cAMP对高血压鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

王瑶函，吴蕊

（河南省阜外华中心血管病医院 心肺功能科，河南 郑州 450003）

高血压以体循环动脉压升高为特征，是伴有心脏、血管、脑和肾脏等器官功能性或器质性损害的临床综合征[1]。高血压治疗不及时将导致脑溢血、动脉硬化、心肌梗死、肾衰竭和失明。高血压的发病率和病死率逐年在增加，已严重威胁人类的生命与健康[2]。3'，5'-环化腺苷一磷酸（3'，5'-cyclic adenosine monophosphate, cAMP）在心肌收缩、血管平滑肌紧张性、细胞增殖和蛋白质的合成等多种生物学活动中发挥作用[3]。本研究通过实验观察cAMP对高血压鼠血管平滑肌细胞增殖的影响，并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

WKY大鼠20只，体重200～215 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2016-0011。20只大鼠随机分为高血压鼠和正常鼠，每组各10只。

1.2 试剂与仪器

蛋白提取试剂盒（美国Thermo Scientific公司），DMEM培养液、胎牛血清（美国Gibco公司），MTT试剂盒、DAB试剂盒、ROS试剂盒（广州碧云天公司），腺苷酸环化酶激活剂（Forskolin，FSK）、一氧化氮合酶抑制剂（N-Nitro-L-arginine Methyl Ester，LNAME）、胶原酶Ⅰ、db-cAMP（美国Sigma公司）及其配套供给的稀释溶剂，兔抗鼠Giα2抗体、兔抗鼠Giα3抗体、羊抗鼠表皮生长因子受体（EGFR）抗体、兔抗鼠p-EGFR抗体、兔抗鼠细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）抗体、兔抗鼠p-ERK1/2抗体、羊抗鼠原癌基因（c-Src）抗体、兔抗鼠pc-Src抗体和Dynein抗体（美国Abcam公司），ECL发光液（美国Millipore公司）。流式细胞仪（FACSVerse，美国BD公司），凝胶成像仪（GelDoc-It，美国UVP公司），酶标仪（ELX800，美国Bio-Tek公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 一氧化氮（NO）缺乏性高血压鼠模型的复制[4]正常鼠常规饲养，高血压鼠每日喂食L-NAME，每天灌胃给药L-NAME 1次，剂量为6 mg/kg，连续给药1周和3周后，每天对大鼠进行24 h动态血压检测和活动记录，大鼠动态血压的收缩压/舒张压符合白昼＞150/100 mmHg，夜间＞140/90 mmHg时为高血压。

1.3.2 血管平滑肌的原代培养 正常和高血压大鼠脱颈处死，75%酒精浸泡2～3 min，无菌台中迅速将胸/腹主动脉取出，放到盛有预冷的PBS的平皿中清洗表面的凝血块。把主动脉放到盛有DMEM+双抗的培养皿中用手术钳除去外膜和脂肪。将血管纵向剪开，用刀片自上而下轻轻刮2下，除去内膜。放到加有3～5 ml 1 mg/ml胶原酶Ⅰ+DMEM+双抗的15 ml管中，室温孵育3 h。用20% FBS+双抗的DMEM洗血管，把血管切成1 mm3的小片，内膜一面朝下贴向培养瓶底，放到5% CO2培养中培养4 h贴壁后加入适量的20% FBS+双抗的DMEM液。培养过夜。第2天换液，待组织处长出细胞后移去组织，继续培养细胞，待后续实验用。

1.3.3 流式细胞仪检测活性氧（ROS） 取培养的正常鼠和高血压鼠血管平滑肌细胞胰酶消化计数后在24孔板中接种3×104/2 ml个细胞每孔，贴壁培养24 h。正常鼠血管平滑肌细胞加入0.5 mmol/L dbcAMP，高血压鼠血管平滑肌细胞加入0.1、0.3、0.5和1.0 mmol/L db-cAMP培养12 h，同时设空白对照组。弃去培养液，用PBS清洗细胞2次。用无血清DMEM培养液按照1∶1000稀释DCFH-DA探针，使其终浓度为10 μl/L，每孔加入500 μl稀释后的探针，培养箱中孵育20 min。用无血清DMEM洗涤细胞3次，充分洗去未进入细胞的DCFH-DA探针。细胞刮刀收集细胞，流式细胞仪定量检测细胞ROS水平。

1.3.4 噻唑蓝比色（MTT）法检测db-cAMP对正常鼠和高血压鼠血管平滑肌细胞活性的影响 取培养的正常鼠和高血压鼠血管平滑肌细胞消化计数以每孔2×103个细胞（100 μl）的数量接种在96孔板培养24 h，分别加入0.5 mmol/L db-cAMP和FSK，同时设对照组，37℃，5% CO2条件下培养48 h。取出96孔板弃掉培养液，每孔加入100 μl无血清的DMEM培养液，再每孔加入5 g/L MTT 20 μl，继续培养4 h，吸出培养液，加入DMSO 150 μl充分溶解，待甲臜完全溶解后，用酶标仪在波长490 nm处读取吸光度（A490）值。

1.3.5 Western blot检测 取培养的正常鼠和高血压鼠血管平滑肌细胞消化计数以每孔5×104个细胞的数量接种在6孔板培养24 h，正常鼠血管平滑肌细胞加入0.5 mmol/L db-cAMP，高血压鼠血管平滑肌细胞加入0.1、0.3、0.5和1 mmol/L db-cAMP，同时设对照组，37℃，5%CO2条件下培养24 h。用蛋白提取试剂盒提取细胞蛋白，用BCA法测定每组蛋白浓度，每孔总蛋白上样量为50 μg，上完样后进行12% SDS-PAGE凝胶电泳分离后转PVDF膜（80 V，90 min），用封闭液（5%脱脂奶粉）封闭2 h，TBST洗膜5 min/次，洗5次。分别用如下一抗Giα-2（1∶1000）、Giα-3（1∶1000）、p-EGFR（1∶5000）、p-EKR1/2（1∶2000）、ERK1/2（1∶1000）、c-Src（1∶1000）、pc-Src（1∶1000）和Dynein（1∶2000）4℃过夜，TBST洗膜5 min/次，洗5次。分别用稀释比例为1∶1000的对应二抗37℃摇床反应1 h，TBST洗膜5 min/次，洗5次。然后采用ECL发光液显影，凝胶成像仪对蛋白条带进行观察，获取图像，并用Labworks 4.6软件对图像进行灰度分析，记录灰度值，计算目的蛋白与内参蛋白的灰度比值。进行3次独立实验后，进行统计分析。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，均通过正态性检验。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，两组间比较采用成组t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 db-cAMP对正常鼠和高血压鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

在正常鼠中（见图1左），对照组细胞活性水平为（100.0±0.0）%，db-cAMP组和FSK组细胞活性水平均相近，3组整体比较，差异无统计学意义（F=0.483，P=0.324），提示在正常鼠中db-cAMP和FSK对血管平滑肌细胞无促增殖作用。在高血压鼠中（见图1右），对照组细胞活性水平为（100.0±0.0）%，db-cAMP组细胞活性水平为（36.7±0.2）%，FSK组细胞活性水平为（49.1±0.3）%，3组整体比较，差异有统计学意义（F=24.483，P=0.025）；与对照组比较，db-cAMP组和FSK组细胞活性均下降，差异有统计学意义（t=5.916和4.136，P=0.021和0.039），提示db-cAMP和FSK对血管平滑肌细胞具有抑制增殖的作用。

图1 db-cAMP对正常鼠和高血压鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

2.2 db-cAMP对正常鼠和高血压鼠血管平滑肌细胞 Giα2 和 Giα3 蛋白表达的影响

与正常鼠不添加db-cAMP比较，高血压鼠不添加db-cAMP的血管平滑肌细胞中Giα2（见图2A）和Giα3（见图2B）的蛋白表达均增加（t=83.785和32.935，P=0.000和0.001）。①在高血压鼠血管平滑肌细胞中分别加入0.1、0.3、0.5和1.0（mmol/L）db-cAMP后Giα2蛋白表达从开始的158.1逐渐下降，甚至降到比正常鼠不添加db-cAMP时还低，其中高血压鼠的Giα2蛋白表达与正常鼠不添加db-cAMP比较差异有统计学意义（t=22.171、14.008、6.880和31.502，P=0.002、0.005、0.020和 0.001），高血压鼠中添加db-cAMP的Giα2蛋白表达均低于不添加db-cAMP，差异有统计学意义（t=9.949、28.289、57.677和 83.653，P=0.001、0.000、0.000和 0.000）（ 见 图2C和表1）；②在高血压鼠血管平滑肌细胞中分别加入 0.1、0.3、0.5和 1.0 mmol/L db-cAMP 后 Giα3蛋白表达从开始的138.0逐渐下降，最终降到与正常鼠不添加db-cAMP时的水平相近，其中高血压鼠不添加db-cAMP、添加 0.1、0.3 mmol/L db-cAMP 的 Giα3 蛋白表达高于正常鼠不添加db-cAMP，差异有统计学意义（t=32.935、13.313和 7.772，P=0.001、0.006和0.016），高血压鼠中添加db-cAMP的Giα3蛋白表达均低于不添加db-cAMP，差异有统计学意义（t=12.07、24.503、19.804和 22.093，均P=0.000）（见图2D和表 2）。

图2 db-cAMP对正常鼠和高血压鼠血管平滑肌细胞Giα2和Giα3蛋白表达的影响

表1 正常鼠和高血压鼠不同db-cAMP浓度下的Giα2/Dynein蛋白相对表达量比较 （n =10）

表2 正常鼠和高血压鼠不同db-cAMP浓度下的Giα3/Dynein蛋白相对表达量比较 （n =10）

2.3 db-cAMP对正常鼠和高血压鼠血管平滑肌细胞内ROS生成的影响

与正常鼠不添加db-cAMP比较，高血压鼠不添加db-cAMP的血管平滑肌细胞中的超氧阴离子含量明显增加（见图3）。在高血压鼠血管平滑肌细胞中分别加入0.1、0.3、0.5和1.0 mmol/L db-cAMP后血管平滑肌细胞内的O2-含量从开始的42.12逐渐下降，甚至降到比正常鼠不添加db-cAMP时还低，其中高血压鼠不添加db-cAMP、添加0.3、1.0 mmol/L的O2-含量与正常鼠不添加db-cAMP比较差异有统计学意义（t=14.440、3.348和 4.449，P=0.000、0.029和0.011），高血压鼠中添加db-cAMP的O2-含量均低于不添加db-cAMP，差异有统计学意义（t=12.433、16.210、13.633和17.183，均P=0.000）（见表3）。

2.4 db-cAMP对正常鼠和高血压鼠血管平滑肌细胞EGFR蛋白磷酸化水平的影响

与正常鼠不添加db-cAMP相比，高血压鼠不添加db-cAMP的血管平滑肌细胞中EGFR的磷酸化水平表达增加（见图4）。与正常鼠不添加db-cAMP相比，正常鼠添加0.5 mmol/L db-cAMP的血管平滑肌细胞中EGFR的磷酸化水平变化不大，差异无统计学意义（P＞0.05）。高血压鼠血管平滑肌细胞中分 别 加 入 0.1、0.3、0.5和 1.0 mmol/L db-cAMP后EGFR的磷酸化水平逐渐降低，从142.2降低到接近正常鼠不添加db-cAMP时的水平。其中高血压鼠不添 加 db-cAMP、 添 加 0.1、0.3 mmol/L db-cAMP后EGFR的磷酸化水平高于正常鼠不添加db-cAMP，差异有统计学意义（t=68.340、52.952和25.993，P=0.000、0.000和0.001），高血压鼠中添加0.3、0.5和1.0mmol/L db-cAMP后EGFR的磷酸化水平均低于不添加db-cAMP，差异有统计学意义（t=22.080、31.976和 40.912，均P=0.000）。见表 4。

图3 db-cAMP对正常鼠和高血压鼠血管平滑肌细胞内ROS生成的影响

表3 正常鼠和高血压鼠不同db-cAMP浓度下的O2-生成比较 （n =10）

2.5 db-cAMP对正常鼠和高血压鼠血管平滑肌细胞ERK蛋白磷酸化水平的影响

与正常鼠不添加db-cAMP比较，高血压鼠不添加db-cAMP的血管平滑肌细胞中ERK的磷酸化水平明显增加（见图5）。血管平滑肌细胞中ERK的磷酸化水平在高血压鼠血管平滑肌细胞中分别加入0.1、0.3、0.5和1.0 mmol/L db-cAMP后，ERK的磷酸化水平均降低，从139.3直降至78.1，其中高血压鼠不添加db-cAMP、添加0.1、0.5、1.0 mmol/L后ERK的磷酸化水平与正常鼠不添加db-cAMP比较差异有统计学意义（t=54.421、30.797、11.949和27.559，P=0.000、0.001、0.007和0.001），高血压鼠中添加dbcAMP的ERK的磷酸化水平均低于不添加db-cAMP，差异有统计学意义（t=22.695、26.886、45.280和56.967，均P=0.000）。见表 5。

图4 db-cAMP对正常鼠和高血压鼠血管平滑肌细胞EGFR蛋白磷酸化水平表达的影响

表4 正常鼠和高血压鼠不同db-cAMP浓度下的pEGFR/总EGFR比较 （n =10）

图5 db-cAMP对正常鼠和高血压鼠血管平滑肌细胞ERK蛋白磷酸化水平表达的影响

表5 正常鼠和高血压鼠不同db-cAMP浓度下的PERK1/2/总ERK1/2比较 （n =10）

2.6 db-cAMP对正常鼠和高血压鼠血管平滑肌细胞c-Src蛋白磷酸化水平的影响

与正常鼠不添加db-cAMP比较，高血压鼠不添加db-cAMP的血管平滑肌细胞中c-Src的磷酸化水平明显增加（见图6）。高血压鼠血管平滑肌细胞中分别加入0.1、0.3、0.5和 1.0mmol/L db-cAMP后c-Src的磷酸化水平降低，从177.3降至与正常鼠不添加db-cAMP时的水平接近。其中高血压鼠不添加db-cAMP、添加0.1、0.3、0.5mmol/L db-cAMP 后c-Src的磷酸化水平高于正常鼠不添加db-cAMP，差异有统计学意义（t=56.544、93.928、36.290和22.761，P=0.000、0.000、0.000和0.001），高血压鼠中添加dbcAMP的c-Src的磷酸化水平均低于不添加db-cAMP，差异有统计学意义（t=4.411、17.528、23.924和50.542，P=0.012、0.000、0.000 和 0.000）。见表 6。

图6 db-cAMP对正常鼠和高血压鼠血管平滑肌细胞c-Src蛋白磷酸化水平的影响

表6 正常鼠和高血压鼠不同db-cAMP浓度下的pc-Src/总c-Src比较 （n =10）

3 讨论

cAMP是由腺苷酸环化酶信号转导系统所产生的第2信使，在血管平滑肌紧张性和细胞增殖等多种生物学活动中发挥作用[3]。Gs和Gi分别是鸟嘌呤核苷酸调节蛋白的调节因子和抑制因子，它们可以通过调节激素的水平从而调节腺苷酸环化酶的活性和cAMP的表达水平。Gi蛋白的表达减少可以诱导高血压、心肌肥大和心力衰竭等多种病理状态[5]。报道指出，在自发性高血压鼠模型的心血管组织中，Gi蛋白表达、腺苷酸环化酶活性和cAMP的表达异常[6]。在自发高血压鼠模型和醋酸脱氧皮质酮高血压鼠模型的心脏中，Gi蛋白表达增加导致cAMP水平的下降，并且自发高血压鼠模型和醋酸脱氧皮质酮高血压鼠模型中，Giα蛋白表达的增加现象出现于高血压现象出现之前，这表明Giα蛋白表达的增加和cAMP表达的下降可能是高血压发病机制的重要因素[7]。通过用百日咳毒素处理2周大小的自发高血压鼠模型来抑制Giα蛋白的活性，可以有效抑制腺苷酸环化酶的活性并且增加cAMP的表达水平，同时缓解自发高血压鼠模型高血压状态[8]。血管紧张素Ⅱ所诱导的Giα蛋白表达的增加可以被db-cAMP所抑制，从而抑制血管平滑肌细胞的增殖[9]。本研究在探究cAMP对高血压鼠血管平滑肌细胞增殖影响的过程中发现与正常鼠模型中的血管平滑肌细胞相比，高血压鼠模型中VSMC细胞中的Giα蛋白表达水平增加，并且细胞增殖速度加快。有报道指出[10-11]增加内源性血管紧张素Ⅱ（ANG Ⅱ）和内皮素1（ET-1）的表达可以增加Giα蛋白的表达和细胞增殖。

通过研究初步发现在高血压鼠模型中血管平滑肌细胞中，db-cAMP可以通过抑制ROS和ROS所介导的c-Src信号通路来抑制Giα蛋白表达的增加和细胞增殖的提高。cAMP在调节多种细胞增殖具有重要作用。其中cAMP已经被证实可以调节上皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、Swiss 3T3细胞和角质细胞的增殖[12-13]。同时，cAMP也可以抑制多种细胞的增殖，例如白血病细胞和平滑肌细胞[14]。本研究选取db-cAMP，其为可以穿透细胞的cAMP类似物，作用于高血压鼠模型中血管平滑肌细胞时，可以抑制Giα蛋白表达的增加和细胞增殖。db-cAMP对正常鼠血管平滑肌细胞增殖无抑制作用，而在高血压鼠中，db-cAMP对血管平滑肌细胞具有抑制增殖的作用，加入db-cAMP后细胞活性分别大幅降低。高血压鼠血管平滑肌细胞中分别加入db-cAMP后Giα2和Giα3的蛋白表达亦明显降低。

有报道显示[15]在高血压鼠模型的血管平滑肌细胞中，蛋白激酶A（PKA）抑制剂可以抑制db-cAMP对Giα蛋白表达增加和细胞增殖。因此笔者推测dbcAMP对抑制Giα蛋白表达的增加和细胞增殖的潜在分子机制可能是由于PKA细胞通路介导的。本实验发现，db-cAMP不仅可以抑制Gi蛋白表达的增加和细胞增殖，同时还可以抑制ERK1/2的磷酸化，表明在高血压鼠模型的VSMC细胞中，db-cAMP对于抑制Giα蛋白表达的增加和细胞增殖可能是由丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路介导的。EGFR活化可以提高Giα蛋白的表达和促进细胞增殖[16]。本研究同时还发现，加入外源cAMP可以抑制EGFR的活性。初步说明，cAMP可能是通过抑制EGFR的表达从而抑制细胞的增殖和提高Gi蛋白的表达。

c-Src是介导氧应激和EGFR反式激活的主要分子，c-Src抑制因子PP2可以抑制PDGFR和EGFR磷酸化水平的提高[17]。在高血压鼠血管平滑肌细胞中分别加入0.1、0.3、0.5和1.0 mmol/L db-cAMP后，c-Src的磷酸化水平表达降低，0.5和1.0 mmol/L db-cAMP组分别降低。所以初步推测外源cAMP可以抑制高血压鼠模型血管平滑肌细胞中c-Src磷酸化水平。应强调的是，本研究的设计存在较大的不足和局限性：要观察某一物质是否具有某一新的作用，除了要设置阴性对照和阳性对照外（本实验未设计），还应做量-效实验，至少要有5个浓度点，剂量范围至少达100倍。而本研究观察仅有4个点，剂量范围也只有10倍（0、0.1、0.3、0.5和1.0），不是真正的量-效实验，今后将按照此要求设计实验，进行量效关系的研究。

综上所述，本研究初步发现cAMP可以抑制Giα蛋白的表达，细胞增殖，氧化应激，c-Src活化，EGF-R活化。提示db-cAMP抑制高血压鼠模型的血管平滑肌细胞中Giα蛋白的表达提高和细胞增殖可能是由于其可以抑制氧化应激的上升和下游的信号通路。即高血压鼠中cAMP表达水平的增加可能具有保护高血压细胞免受氧应激所诱导的并发症。