近红外无损检测安胎丸中关键质控指标成分的含量＊

马晋芳，王雪利，肖 雪，彭 银，葛发欢＊＊

（1.中山大学药学院 广州 510006；2.中山大学南沙研究院 广州 511458；3.广东药科大学 广州510006；4.广东省中药超临界流体萃取工程技术研究中心 广州 510006）

中药市场中，当进行药品抽样检验时，只是从大量样品中随机抽取少量样品进行质量检测，并不能代表产品的整体质量，且检验方法复杂，耗时费力，便利性较差。如安胎丸，是古代经典方剂，由当归、制川芎、黄芩、炒白芍、白术打粉加工制成的中药复方制剂，具有安胎功效，用于妊娠血虚、胎动不安、面色淡黄、不思饮食、神疲乏力等病症[1]。每盒装为10丸，每丸6 g。当前安胎丸的检验，是依照《卫生部药品标准⋅中药成方制剂》进行性状、显微鉴别、薄层鉴别以及丸剂的各项规定检查[2]。在目前的文献报道中，仅通过指纹图谱[1]及1-3个指标性成分的定量[3-6]评价安胎丸的质量。检测指标少，不能涵盖组方药材，且检测手段需要进行繁琐的前处理，有必要开发一种快速、简便、无损的检测方法。

近红外光谱法是一种利用化学物质在近红外谱区内的光学特性快速测定物质化学组分含量的光谱技术[7-8]。其特点是吸收系数较低、无损、快速、无污染，可以直接对样品进行测定，不需要对样品处理或仅需简单处理[9]。本研究中，采用近红外漫反射光谱无损检测的方法，即光投向安胎丸后，在丸剂内部发生方向不定的反射[10]，直接对其进行检测。待近红外漫反射光谱穿透至一定深度的蜜丸时，获得更加完整的安胎丸整体信息，再结合化学计量学方法，对多批安胎丸中的每一丸进行关键质控指标成分的定量研究，建立一种抽样检验过程中更具有代表性的近红外快速无损检测安胎丸关键质控指标成分含量的方法。

1 材料和方法

1.1 仪器和药材

UltiMate 3000高效液相色谱仪（美国Thermo公司）；十万分之一分析天平（XS205 DuaLRange型，梅特勒-托利多）；紫外分光光度计（UV-2600，岛津（中国）有限公司）；近红外光谱仪（SupNIR1500，聚光科技（杭州）有限公司）；化学计量学分析系统（THUNIR V3.0，清华大学），在线监测分析系统（THU NIR Online，清华大学）；阿魏酸（纯度99.00%）、黄芩苷（纯度93.50%）、汉黄芩苷（纯度98.80%）、黄芩素（纯度98.50%）、汉黄芩素（纯度98.0%）和洋川芎内酯A（纯度98.0%），均购自于中国食品药品研究院。乙腈（色谱级，购于德国默克公司），甲酸（分析纯，广州化学试剂厂）、甲醇及其它试剂均为分析纯。安胎丸（批号为：151101、151002、130701、151001、130602、130501、131101、131201、140401、140402、130601、140404，江西保利制药有限公司）。

1.2 关键质控指标成分实际值的测定方法[11]

1.2.1 混合标准品溶液的制备

精密称取各标准品于容量瓶中，加适量甲醇溶解配制成混合标准品母液，并稀释至如下浓度：阿魏酸0.00306 mg⋅mL-1、黄芩苷0.10250 mg⋅mL-1、汉黄芩苷0.01840 mg ⋅mL-1、黄芩素 0.064 mg ⋅mL-1、汉黄芩素0.0378 mg⋅mL-1、洋川芎内脂0.00715 mg⋅mL-1、白术内酯0.042 mg⋅mL-1。

1.2.2 样品溶液的制备

取1丸安胎丸，剪碎，取约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇，密塞，称量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）45 min，放冷，再称量，用甲醇补足减失的量，摇匀，即得供试品溶液（平行制备三份）。

1.2.3 色谱条件[11]及测定方法

色谱柱Diamonsil Plus C18-A(250×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.1%磷酸溶液（A）：乙腈（B），梯度洗脱（0-15 min，5%-20%B；15-40 min，20%-40%B；40-45 min，40%-70%B；45-55 min，70%-90%B；55-60 min，90%-95%B）；流速 0.8 mL·min-1；柱温 35℃；检测波长280 nm；根据六种关键指标成分的化学结构公式(图1)，达到了令人满意的分离效果。样品和标准溶液采用0.45 μm微孔膜过滤，分别取10 μL经HPLC检测。所测得的数值作为六种关键质控指标性成分的含量真实值。

混合标准品溶液和样品溶液均经HPLC仪测定安胎丸中关键质控指标成分的含量。

1.3 关键质控指标成分的近红外测定方法

1.3.1 近红外光谱数据的采集

取12批（共108丸）的安胎丸样品，采用近红外光谱仪进行近红外光谱数据的采集，按如下条件扫描：漫反射模式，分辨率2 nm，扫描次数32次，波长扫描范围1000-1800 nm。每丸重复扫描3次，得出平均的准确的光谱数据保存为txt格式，并转换为CVS格式。

1.3.2 光谱的预处理

光谱预处理对于获得可靠、稳定和准确的模型至关重要，因为近红外的光谱的数据中可能包含噪声、背景信息和其他干扰因素[12]。本研究中，分别近红外采集的光谱进行了预处理，比较了一阶导数卷积（1stderivative，1DC）、二阶导数卷积（2ndderivative，2DC）、多元散射校正（Multiplicative Scatter Correction，MSC）、标准正变变换（Standard Normal Variate，SNV）、Savitzky-Golay卷积平滑（S-G）和归一化法（Normalization Method）等光谱预处理方法。

1.3.3 模型的建立及预测方法

采用THUNIR软件[13-14]，根据HPLC测定的六种关键质控指标成分的真实含量值，对采集到的光谱进行光谱预处理和波段选择，选择偏最小二乘法（partial least squares，PLS）[15]，建立六种成分的定量校准模型。

模型的优劣主要以交叉验证标准误差（SECV）和相关系数（R2）进行评估[12-13]。

采用建立的定量校正模型，对安胎丸中六种关键质控指标成分的含量进行预测，并与HPLC测定结果进行比较分析。

2 结果与分析

2.1 关键质控指标成分的实际值测定

2.1.1 HPLC测定的标准曲线及方法学考察

采用高效液相色谱法绘制了安胎丸六种关键质控指标成分的标准曲线：阿魏酸：Y=56.5343 x+56.5343（0.0006-0.0245 μg）；黄芩苷：Y=43.9359 x+43.9359（0.0205-0.8200 μg）；汉 黄 芩苷 ：Y=57.4254 x+57.4254（0.0092-0.1840 μg）；黄芩素：Y=87.5326 x+87.5326（0.0128-0.5120 μg）；汉黄芩素：Y=90.0406 x+90.0406（0.0076-0.3780μg）；洋川芎内酯 A：Y=14.5638 x+0.0075（0.0014-0.1072μg）。

方法学考察中，精密度试验的RSD值为0.53%-0.85%、重复性试验的RSD值为2.28%-4.71%、稳定性试验的RSD值为0.75%-4.00%，均低于5%。加样回收率试验采用加入100%浓度的六份样品进行测定，回收率在98%-105%之间，RSD低于3%。实验结果表明，方法学考察均符合要求，可见该HPLC测定方法的精度高、重复性好、稳定性好、回收率高。

图2 安胎丸的HPLC图

表1 安胎丸中关键质控指标成分的含量测定表（mg·pill-1）

续表1

表2 安胎丸关键质控指标成分的含量测定表（mg·pill-1）

图2是安胎丸样品溶液和标准品溶液的HPLC色谱图，表明六种关键质控指标成分不存在有峰干扰，且各成分归属于不同的色谱峰，可以准确进行定量，定量结果见表1。

2.2 关键质控指标成分的近红外定量模型的建立

2.2.1 近红外校正集样本和验证集样本的划分

针对上述测定的每一批号中各丸所含质控指标成分的含量，将所有的样本（108丸）分为校准集和预测集。且分别由84个和24个样本组成，如表2所示，并对校正集或验证集的六个质控指标成分含量进行比较，校准集的含量范围更大，且含量数据分布均匀，符合建模条件。

2.2.2 近红外光谱的特性分析

近红外光谱分析常用的光谱区域是780-2500 nm，所测特征是分子振动基频，尤其是伸缩和弯曲振动的倍频和组合频吸收带[15]。图3显示了安胎丸的原始光谱图和预处理光谱图的光谱。在卷积平滑的光谱预处理中，1150-1210 nm、1300-1500 nm和1450-1600 nm均有较大响应，这与-CH2、和-CH的二级倍频、-OH的伸缩振动有关[15]。

2.2.3 主成分分析

主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）是一种根据光谱分数对不同样本进行分类的合适方法，可用于验证光谱的一致性[16]。图4显示了光谱的得分图。实验结果显示，12批次安胎丸从其PCA得分图看出，两年内生产的样本不存在明显的异常值。因此，108丸安胎丸具有光谱的一致性。

2.2.4 近红外光谱的预处理和波段选择

对近红外光谱仪采集的光谱数据进行光谱预处理，可以消除偏移或基线的变化，从而保证光谱数据和成分之间很好的相关性[13]。在本研究中，选择光谱扫描范围为1000-1800 nm。考察几种光谱预处理方法包括：S-G、1DC、2DC、MSC、SNV等不同预处理方法，最大程度地减少光谱中存在的干扰，并对上述光谱预处理方法进行比较，分别选出最佳光谱预处理方法：六种质控指标成分的最佳光谱预处理方法均为卷积平滑（窗口数为11，拟合次数为3）[17]。

校正模型建立时，有时并不需要所有的光谱数据都参与校正，而只用某些光谱区间就可以得到很好的校正效果，这样可以减少参与建模的数据量，降低不相关区间的噪音干扰。因此，本研究中，采用化学计量学软件提供的光谱区间选择功能，进行不同的波长选择方法的比较，优选出最佳波段进行模型的建立，最佳波段的优选结果见表3。

图4 安胎丸全部样本的近红外光谱PCA得分图

2.2.5 模型主因子数的确定

采用PLS方法建立定量分析模型时，主因子数的选择直接影响到模型的实际预测能力，如果选择的主因子太少，将会丢失原始光谱较多的有用信息，导致拟合不充分；如果选择主因子太多，会将测量噪音过多的包括进来，出现过拟合现象，所建模型的预测误差会显著增大[18]。本研究以黄芩苷为例，随着主因子数增加，SECV陡然下降，防止存在过拟合现象，因此，选择主因子数为7。

2.2.6 建立最佳定量校准模型

定量校正也称多元校正[19]，是指在物质含量与分析仪器响应值之间建立定量关联关系。PLS属于线性方法，是基于有偏估计的方法，能同时对回归问题进行降维处理[19]。

本研究中根据表1中六种质控指标成分的含量测定结果，采用THUNIR软件，应用卷积平滑的光谱预处理方法，选择优化后的最佳波长，结合偏最小二乘法分别建立近红外光谱测定安胎丸六种成分的定量校正模型。六种成分的定量分析模型参数见表3。

图5 黄芩苷定量分析校正模型最佳主因子数的选择

2.3 定量校准模型的验证

采用建立的六种关键质控指标成分的定量校准模型，分别对剩余的24个验证集样本进行含量预测，如图6，结果显示安胎丸中的六种关键质控指标性成分的真实值与预测值高度匹配，其预测的相关系数R2均≥0.90，表明六个模型具有较好的预测能力。

表3 安胎丸质控指标成分最佳模型校正参数

图6 安胎丸六种质控指标性成分的预测值与真实值拟合图

3 讨论

本研究采用近红外漫反射光谱分析技术，成功地对安胎丸进行了六种质控指标成分的定量分析，该方法可以无损、快速、准确地对该中成药进行质量评价。与市场抽样检验方法比较，可以节省大量分析时间及费用，有着良好的市场实用价值和应用前景，为中成药市场的抽样检验提供新思路和新方法。