近红外光谱法快速测定山银花中四种有机酸＊

张 易，方 婷，马晋芳，凌亚东，彭 银，葛发欢＊＊

（1.中山大学药学院 广州 510006；2.广东省中药超临界流体萃取工程技术研究中心 广州 510006；3.广东药科大学广州 510006；4.广州讯动网络科技有限公司 广州 510630）

山银花是忍冬科植物灰毡毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.）、红 腺 忍 冬（Lonicera hypoglauca Miq.）、华南忍冬（Lonicera confusa DC.）或黄褐毛忍冬（Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng）的干燥花蕾或初开的花，为中医常用药，应用历史悠久[1]，具有清热解毒，疏散风热的作用，用于治疗痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温热发病[2]。山银花中有机酸的种类主要有咖啡酰奎宁酸类（包括绿原酸、异绿原酸、新绿原酸等）和咖啡酸[3]，其中绿原酸和异绿原酸类成分（异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C等）为山银花的主要抗菌活性成分[4]。目前多采用高效液相色谱法（HPLC）测定山银花中绿原酸和异绿原酸成分的含量，并进行质量控制研究[4-6]，该分析方法大多需要破坏样品，需对样品预处理、提取、稀释、检测分析等复杂步骤，耗时耗力。

近红外光谱（near-infrared spectroscopy，NIR）分析技术是目前发展最快和最具有前景的过程分析技术之一，结合化学计量学和计算机技术，可实现对药物化学成分含量预测[7,8]，具有样品处理简单、无损耗、快速等诸多优点。已有报道NIR技术测定金银花药材和提取过程中多种指标成分的含量[9-11]，但尚未有用该方法同时快速测定山银花提取过程中多指标成分含量的文献报道。

本研究将NIR应用于山银花提取过程中绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C含量的快速分析，利用偏最小二乘（PLS）法建立四种有机酸的定量校正模型，模型经评价后用于测定未知样品（验证集）四种成分的含量，采用相关系数、预测均方根误差及相对预测偏差评价NIR预测结果的准确性，建立NIR快速测定山银花提取过程中绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C含量的方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

近红外光谱仪（型号：NGD-U10，广州讯动网络科技有限公司）；Matlab2012a版软件（美国MathWorks公司）；Ultimate 3000 HPLC仪（包括梯度泵SR-3000、自动进样器WPS-3000、柱恒温系统TCC-3000、紫外检测器DAD-3100、色谱工作站变色龙7.2）（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；十万分之一分析天平（型号：XS205 DuaLRange，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）。

1.2 材料

山银花（市售），经中山大学药学院葛发欢教授鉴定为忍冬科植物山银花的花蕾，存放于中大南沙研究院；绿原酸（批号：110753-200413，纯度≥98%，中国药品生物制品检定所）；异绿原酸A（批号：15041720）、异绿原酸B（批号：15042210）、异绿原酸C（批号：15110702）均采购自成都普瑞法科技开发有限公司，纯度≥98%；乙腈（色谱纯，德国默克公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品采集

取山银花粉末约100 g，加3 000 mL水，80℃加热回流2 h，每隔2 min收集一次提取液，共提取4批，得到240个样品，其中2批样品用于建立校正模型，2批样品用于验证模型的准确性。

2.2 NIR谱图的采集

用近红外光谱仪对待测样品进行近红外扫描。波长扫描范围为950-1 650 nm，每次光谱扫描次数为100次，分辨率为2 nm，每个提取液样品重复扫描3次。计算光谱平均值。样品的近红外图谱见图1。

2.3 山银花提取液中四种有机酸的含量测定

精密称取各标准品适量，用50%甲醇溶解至刻度，得到混合标准品母液储备液。然后精密吸取适量储备液制成不同浓度的混合标准品溶液。色谱柱为Sharpsil-AQC18（250 mm×4.6 mm,5 μm），流动相为A为0.4%磷酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱（0-15 min，15%B，15-30 min，15%-30%B，30-45 min 30%B，45-48 min，30%-15%B），流速为0.5 mLmin-1，柱温25 ℃，检测波长：230 nm。取“2.1”项下的样品，过0.45 nm滤膜，取滤液进行液相分析。四种有机酸的分离度、精密度、重复性和稳定性均符合分析要求。线性方程分别为：y=31.637x-0.076 2（绿原酸）；y=37.035x-0.062 5（异绿原酸 A）；y=29.674x-0.017 7（异绿原酸 B）；y=32.033x-0.062 7（异绿原酸C）。相关系数R2均为1.000。四种成分的校正集和验证集的HPLC含量及数据分析分别见表1、表2。

图1 山银花提取液近红外图谱

2.4 定量分析模型的建立

2.4.1 波段的选择

采用Matlab2012a版软件进行建模，四种有机酸的建模波段为950-1 650 nm。通过交叉验证均方根误差（RMSECV）和预测均方根误差（RMSEP）对建模波段进行评价[12]。当RMSEP值远大于RMSECV值时，说明选择的建模样品的代表性差，而当RMSEP值远小于RMSECV值时，表明验证样品的代表性差。本文采用全光谱范围即950-1 650 nm进行建模，从表3可以看出，RMSEP和RMSECV值均较小且接近，说明选择的样品具有代表性。因此选择建模波段为950-1 650 nm。

2.4.2 主因子数的选择

主因子数的大小对PLS模型的预测效果有显著影响。主因子数过少，会出现“欠拟合”现象；而主因子数过多则出现“过拟合”现象，两者均会导致模型的预测能力下降[13]。故本实验采取内部交叉验证方法，考察不同主因子数对RMSECV的影响，优选出最佳的主因子数。结果见图2。结果表明，随着主因子数增加，RMSECV陡然下降。RMSECV值最小时，对应的四种有机酸的最佳主因子数分别为：19、19、19和18。

2.4.3 模型的建立及外部验证

表2 四种成分在校正集和验证集中的HPLC含量测定结果分析

表3 四种有机酸模型的内部交叉验证及外部验证结果

为了检验校正模型的可靠性与稳定性，除了进行内部交叉验证以外，还需对模型进行外部检验。根据相关性来判断是否具有异常值。将HPLC法测得的绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C含量值与其950-1 650 nm波段下的NIR谱图导入软件，得到四种成分的定量分析模型及其预测值。模型性能评价指标汇总见表3。四种成分的预测值与真实值的相关图见图3。当R值越接近于1时，模型的预测越准确；当RMSECV值越小且与RMSEP接近，相对预测偏差RSEP越小时表明模型预测效果越好。结果表明，所建模型的准确性和稳定性良好，校正集样本均匀地分布在回归线的两侧，预测值与实测值的线性相关性较好。所建模型对验证集中四种有机酸含量的预测结果见图4。四种成分的相对预测偏差RSEP值较小，能够满足中药实际生产过程中分析精度的要求。

3 讨论

本研究应用NIR分析技术建立了山银花提取过程中绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B及异绿原酸C四种成分同时快速检测方法。所构建的PLS定量模型通过初步验证具有良好的稳定性和精确度，相对预测偏差RSEP在合理范围内，可用于对未知样品的预测。

在实际提取过程中，如果采用在线控制系统，只需要扫描山银花提取物的NIR光谱，并将其代入所建立的定量模型中即可同时快速预测绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B及异绿原酸C成分的含量。样品分析极其简单，极大节省了检测时间（一般一个样品扫描一次只需1～2 s），提高了分析效率。该方法弥补了传统HPLC分析存在的费时费力、环境污染等缺陷，具有广阔的应用前景。

图2 四种有机酸定量模型的最佳主因子数选择

图3 四种有机酸的NIR预测值与HPLC测定值的相关性

图4 验证集中四种有机酸NIR预测值与真实值的相对趋势