丹参素钠大孔树脂吸附分离过程的近红外在线监测研究＊

马晋芳，毕昌琼，欧邦露，肖 雪，王雪利，葛发欢＊＊

（1.中山大学药学院 广州 510006；2.中山大学南沙研究院 广州5 11458；3.贵州景峰注射剂有限公司 贵阳 550018；4.广东药科大学 广州 510006；5.广东省中药超临界流体萃取工程技术研究中心 广州 510006）

丹参为传统名贵中药，是唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎，味苦，性微寒，归心、肝二经，具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈的功效[1]。参芎葡萄糖注射液是由丹参、盐酸川芎嗪经过现代工艺制造的一种用于闭塞性脑血管疾病及其他缺血性血管疾病的现代复方制剂[2-4]。丹参中的水溶性酚酸类成分主要有丹参素、丹酚酸B等。现代药理研究表明，丹参酚酸类成分具有改善循环、抑制血小板聚集、抗氧化、增加冠脉流量及心肌供氧量等作用，是丹参祛瘀、活血的主要活性成分[5-6]。

参芎葡萄糖注射液中，丹参其经过复杂的生产工艺制备得到以丹参素为主要成分的提取物。因此，为了保证该产品质量的稳定性和均一性，同时为了节约企业成本，需要对生产过程进行质量控制，但目前实际生产过程中的质量控制缺乏在线监测手段，无法及时地对有效成分含量做出分析。由于近红外光谱（NIR）是近年来发展迅速且应用广泛的一种分析技术，且具有分析方便快速，绿色环保，可多成分同时在线检测等优点[7]。

本研究采用近红外光谱分析技术结合化学计量学，对丹参大孔树脂吸附分离过程中的丹参素钠含量进行定量分析，并在线监测大孔树脂吸附分离过程中丹参素钠含量的变化，为参芎葡萄糖注射液大生产过程中大孔树脂吸附分离单元的在线质量控制奠定基础。

图1 丹参素钠大孔树脂吸附分离阶段在线近红外原始光谱

1 材料和方法

1.1 仪器和药材

UltiMate 3000高效液相色谱仪（美国戴安公司）；XS205 DuaLRange型十万分之一分析天平（梅特勒-托利多）；UV-2600紫外分光光度计（岛津（中国）有限公司）；Matrix-F近红外光谱仪（德国布鲁克公司）；化学计量学分析系统（THUNIR V3.0（Demo），清华大学），在线监测分析系统（THU NIR Online（Demo），清华大学）；中小型提取罐（30 L）。乙腈（色谱级，德国默克），甲酸（分析级，广州化学试剂厂）；丹酚酸B标准品（批号：111562-201514，中国食品药品检定研究院）；丹参素钠标准品（批号：110855-201412，中国食品药品检定研究院）；丹参提取液、丹参柱层析液（实验室中试生产线制备）。

1.2 收集样品

丹参药材300 kg，经实验室中试生产线制备得到的丹参素钠提取物，经大孔树脂上样吸附后，用6 BV纯化水进行冲洗，流速均为6 BV/h，从开始收集水洗液的同时，每隔1 min采样一次，过0.45 μm微孔滤膜，置于密封容器中存放（共制备五批样本）。

1.3 丹参素钠的含量测定

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Luna 5u C18(2)100A（250×4.6 mm）；流动相体系：乙腈（A相）-0.4%甲酸水溶液（B相）；梯度洗脱，0～18 min，7%～14%A，流速为1 mL/min，柱温30℃，检测波长：280 nm，检测器：DAD检测器，进样量10 μL。

1.3.2 溶液的配制

精密称取丹参素钠标准品7.02 mg于10 mL容量瓶中，加适量水溶解并定容至刻度，摇匀，作为丹参素钠对照品溶液。收集大孔树脂工艺水洗液样品，作为供试品溶液。

1.3.3 测定方法

分别对照品溶液和供试品溶液，经HPLC测定其中丹参素钠的含量。

1.4 NIR光谱的采集[8-9]

大孔树脂吸附分离过程中，采用透射在线采集，以空气为背景，光程2 mm，扫描范围800～2 500 nm，分辨率2 nm，扫描次数32次，每个采样点重复扫描3次，求平均光谱，采集的近红外原始光谱图如图1所示。

1.5 数据处理与软件

根据THU NIR Online（Demo）[10]在线监测分析系统对大孔树脂工艺过程终点的判定和吸附分离过程的趋势的判断，选择符合生产条件的样本。

采用THUNIR V3.0（Demo）化学计量学分析系统，结合马氏距离图对样品中存在的异常点进行剔除，确定建模所用的校正集、外部验证集及在线验证集。然后在此基础上对原始光谱进行光谱预处理，并选择建模的光谱区间，结合偏最小二乘法对样本的光谱与其性质的相应含量值建立定量校正模型。

通过验证模型预测值的精度和可信度，进而判断模型的优劣以及拟合程度，也称为模型精度的评价[11-12]，模型精度高，证明该模型具有实际应用价值，对未知样本的预测才具有意义。

2 结果与分析

2.1 标准方法的测定值

高效液相色谱法建立丹参素钠标准曲线，方程为Y=7.5479X-0.0825，R2=0.9999，线性范围在 0.0035～1.4040 mg·mL-1。作为校正集批次1～3的丹参素钠质量浓度范围在0.0009～1.1740 mg·mL-1，作为外部验证集批次4的丹参素钠质量浓度范围在0.0011～1.0245 mg·mL-1，作为在线验证集批次5的丹参素钠质量浓度范围在0.0011～0.8650 mg·mL-1。结果表明外部验证集和在线验证集的丹参素钠质量浓度均落在校正集范围内，具体测定结果见表1～3。

2.2 近红外定量校正模型的建立

2.2.1 在线监测软件分析大孔树脂吸附分离阶段

采用THU NIR Online（Demo）软件对丹参大孔树脂吸附分离过程中的各批次进行分析比较[21]，光谱波长选择为800-2500 nm，排除噪声干扰，根据在线监测分析的结果检测目标成分的变化情况，如图2所示从左向右，曲线趋势逐渐趋于平衡，提示达到柱层析终点。通过比较各个批次，选择提取过程趋势一致的五个批次进行模型的建立与预测分析。

表1 校正集样本中丹参素钠含量测定结果表

续表1

表2 外部验证集中丹参素钠的含量测定结果表

2.2.2 建模方法的选择[13-15]

近红外光谱分析技术中，常用的线性校正方法有多元线性回归（MLR）法、主成分回归（PCR）法、偏最小二乘（PLS）法。

多元线性回归（MLR）法又称为逆最小二乘法，该方法计算简单，但由于光谱变量之间往往存在共线性问题，无法求光谱阵的逆矩阵或求取的逆矩阵不稳定，从而在很大程度上降低了所建模型的预测能力，使MLR方法在近红外光谱分析中的应用受到了很大限制。

表3 在线验证集中丹参素钠的含量测定结果表

主成分回归（PCR）法是采用多元统计中的主成分分析（PCA）法，先对近红外光谱矩阵进行分解，然后选取主成分得分来进行多元线性回归运算，得到定量模型。但PCR中，只对光谱阵进行分解，消除无用的噪声信息。

偏最小二乘（PLS）法是把矩阵分解和回归并为一步，即对光谱阵和浓度阵分解的同时，将浓度阵的信息引入到光谱矩分解过程中，在每计算一个新主成分前，将光谱阵的得分与浓度阵的得分进行交换，使得光谱阵主成分直接与浓度关联。这样可以克服PCR只对光谱阵进行分解的缺点，且PLS建立的模型预测能力与稳定性良好，噪音去除明显，并能有效解决模型的过拟合与变量共线性。

因此，本研究选择PLS法旨在得到稳定性高、预测能力准确的丹参素钠定量校正模型。

2.2.3 光谱预处理

图2 大孔树脂吸附分离阶段的在线监测分析图

本研究采用THUNIR V3.0（Demo）化学计量学分析系统，参考仪器自带的优化功能，对光谱预处理方法进行优化，剔除干扰信号，提取关键信息，来选择最佳光谱预处理方法提高模型的稳定性和预测的准确性。光谱预处理方法中，卷积平滑可以消除噪音对光谱的影响，多元散射校正和标准正态变量变换可以消除各批次间样品产生的散射对其光谱的影响，一阶卷积求导可以消除常数背景，二阶卷积求导消除线性背景等等。不同的光谱预处理方法所建立的模型性能评价指标见表4。结果显示丹参素钠建模光谱最佳预处理方法为二阶卷积求导。

2.2.4 建模波段的选择

图3 丹参素钠定量校正模型预测趋势图

表4 丹参素钠光谱预处理方法的选择

表5 建模波段的比较结果表

偏最小二乘法虽可以处理全光谱信息，但因其中会含有大量无效的信息，故需要对最佳的波长范围进行筛选，以消除干扰，提高模型的精度。本研究采用二阶卷积求导的光谱预处理方法，通过比较全波长、相关系数法、迭代优化波长选择方法，优选最佳建模波段为833～1 165 nm，1 498～1 890 nm，具体见表5。

2.2.5 模型的建立

运用化学计量学分析系统THUNIR V3.0（Demo）软件，对上述光谱预处理方法和建模波段进行优选，依据标准方法的测定值，采用PLS法建模，得丹参素钠定量校正模型的R2值为0.8473，SECV值为0.1776。

2.3 近红外定量校正模型的外部验证与在线验证[16-19]

对划分的外部验证集和在线验证集进行丹参素钠的含量预测，并与HPLC法测定结果进行比较，外部验证集的预测结果显示，从纯水洗脱开始，最初7个样本和最终8个样本的预测值和真实值的相对偏差大于10%，其余样本的相对偏差都较小；在线验证集的预测结果显示，从纯水洗脱开始，最初8个样本和最终12个样本的预测值和真实值的相对偏差大于10%，其余样本的相对偏差都较小。可见，在大孔树脂吸附分离过程中，水洗阶段最初收集液部分和最终收集液部分中，所含丹参素钠的含量太低，导致模型的预测不准确，只能准确预测出水洗液中丹参素钠的含量趋势和提示水洗的起点和终点，而中间部分由于洗脱液中丹参素钠的含量高，所以可以准确预测，具体见图3。

3 讨论

本研究利用近红外光谱法，在线对参芎葡萄糖注射液大孔树脂吸附分离中试生产过程进行丹参素钠的质量控制，通过二阶卷积求导的光谱预处理方法和选择最佳波段（833～1 165 nm，1 498～1 890 nm），结合PLS法建立定量校正模型，不仅可以准确预测大孔树脂吸附分离过程中丹参素钠的含量，同时可以准确判断大孔树脂吸附分离的起点和终点，在参芎葡萄糖注射液大生产中，可以实现丹参素钠实时监控和在线分析，并且以其快速、环保的优势为其产品的生产节约成本，提高效率，可以作为一种中药制药过程中质量控制的新方法在中药制剂的复杂工艺中试行及推广。

此外，大孔树脂吸附分离过程不同于普通的提取过程，由于洗脱液中目标成分的含量是从无到有，再到无，结合近红外光谱本身的缺点是不能检测含量太低的物质，所以在采用近红外检测技术进行质量控制时，对洗脱的起点和终点，仅能做准确判断，无法做到准确定量，目前应用暂仅对洗脱的中间部分进行准确定量。