优化荜茇多糖的提取工艺及其抗氧化活性研究＊

马 岚，王慧敏，陈建平，成日青，齐和日玛，郭慧卿，塔 娜

（内蒙古医科大学 呼和浩特 010110）

荜茇（piper Longum L）是胡椒科胡椒属植物，其干燥成熟的果穗可入药[1]，是中、蒙、藏、维医的习惯用药，具有调理胃火、祛“巴达干·赫依”、调节体素、滋补强壮、平喘、祛痰、止痛之功效[2-3]。现代药理学研究表明，荜茇具有抗癌、保肝、抗氧化、抗炎、免疫调节、扩张冠状动脉血管、抗菌、抗血小板、抗高血脂、保护心肌、抗抑郁等药理学作用[4]。荜茇中含有多糖类物质，大量的药理和临床研究表明，有些植物多糖具有独特的药理及生物活性，比如提高免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血糖、降血脂等，并具有无毒、副作用小等优点[5-6]。所以中蒙药中多糖的研究不仅成为热门领域，也成为当今中蒙药的研发方向之一[7]。

基于多糖的这些优点，本文采用苯酚－硫酸法测定荜茇多糖（Piper Longum Polysaccharides，PLP）的含量，通过考察提取温度、提取时间、提取次数等影响因素对PLP的提取工艺进行地研究，并采用正交试验法优化提取工艺，最终确定最佳工艺条件，通过ABTS、DPPH自由基清除实验，对PLP的抗氧化活性进行初步研究，为今后开发荜茇多糖天然抗氧化剂奠定基础。

1 实验仪器及材料

1.1 实验仪器

DR6000紫外分光光度计（美国哈希公司）；旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；ZKB-1-4型循环水多用真空泵（巩义市英峪仪器厂）；BFX5—320型低速自动平衡离心机（白洋离心机厂）；KH-250DB型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；恒温水浴箱（北京市长风仪器仪表）；恒温鼓风干燥箱（福利达实验仪器厂）；BSA124S分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；

1.2 材料与试剂

荜茇（购自呼和浩特市天力药业，产地：广西，经内蒙古医科大学药学院药用植物学教研室乔俊缠教授鉴定为胡椒科植物荜茇的干燥成熟果穗），ABTS[2,2′-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐]、DPPH（2,2-联苯基-1-苦基肼基）、D-无水葡萄糖标准品（中国食品药品检定研究院，纯度99.9%，批号：110833-201506）、乙醇（95%）、无水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、氢氧化钠、磷酸二氢钾、过硫酸钾、抗坏血酸（VC）、苯酚、浓硫酸、溴化钾、活性炭等均为分析纯。

2 方法

2.1 PLP的制备

称取蒙药荜茇5.0 g，加入100 ml 95%乙醇加热回流60 min后过滤，除去脂溶性物质及色素，将残渣挥干，然后倒入圆底烧瓶中加入150 ml蒸馏水加热回流提取60 min[8]，趁热将提取液进行抽滤，依上述方法重复提取一次，然后将两次提取液旋蒸浓缩约至20 ml，按1∶2比例加入40 ml乙醇溶液（95%），静置24小时。然后抽滤，用无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤沉淀。将沉淀挥干，用蒸馏水溶解并定容至100 ml容量瓶中。吸取上述溶液10 ml，置于100 ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。

2.2 PLP的含量测定

2.2.1 测定波长的选择

精密吸取葡萄糖对照品溶液1.0 ml供试品溶液1.0 ml分别置于试管中，用蒸馏水定容至2.0 ml，加入5%苯酚溶液1.0 ml，浓硫酸5.0 ml，于40℃水浴中反应30 min后置于冷水中冷却，在400-800 nm进行波长扫描，吸收光谱显示对照品和供试品分别在491 nm和490 nm处有最大吸收，故选择490 nm作为测定波长。

2.2.2 苯酚-硫酸法显色反应的探索

空白液的制备：精密吸取2.0 ml蒸馏水，加入0.5 ml的5%苯酚和5.0 ml浓硫酸，置于具塞比色管中。

供试品液的制备：精密吸取1.0 ml蒸馏水，1.0 ml供试液，分别吸取5%苯酚溶液 0.5、1.0、1.5、2.0 ml，5.0 ml浓硫酸，分别置于试管中。

将上述溶液于40℃水浴中反应30 min后置于冷水中冷却，490 nm波长处测定其吸光度。吸光度分别为：

依上述结果可知，当加入的苯酚体积为1.5 ml时吸光度最大，所以确定后续的苯酚-硫酸显色法所加入的5%苯酚溶液的体积为1.5 ml。

2.2.3 标准曲线的绘制

采用苯酚—硫酸法测定PLP的含量，葡萄糖标准曲线绘制如下：

表1 荜茇供试品的浓度及其吸光度

表2 精密度实验结果

表3 重复性实验结果

分别精密量取葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 ml置具塞比色管中，用蒸馏水稀释至2.0 ml，加5%苯酚溶液1.5 ml，浓硫酸5.0 ml，于40℃水浴中反应30 min显色后置于冷水中冷却，采用紫外—可见分光光度计在490 nm处测定吸光度。以吸光度（A）为纵坐标，以溶液浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度实验

吸取适量供试品溶液，按2.32项下方法操作显色，于490 nm处连续取样测定吸光度5次，其RSD值为0.23%，表明该方法精密度良好（表2）。

2.3.2 重复性实验

精密称取蒙药荜茇5.0 g，分别制备5份供试品溶液，分别按2.2.3项下方法操作显色，于490 nm处测定吸光度，其RSD值为0.84%，表明该方法重复性良好（表3）。

2.3.3 稳定性实验

吸取适量供试品溶液，按2.2.3项下方法操作显色，自加水定容摇匀开始计时，分别于10、20、30、45、60 min取样测定吸光度，结果见表4。与计时10min后的数据比较，60 min后吸光度下降了0.33%，表明供试品溶液在60 min内稳定性较好。

2.3.4 加样回收率实验

精密称取荜茇5.0 g，共9份，分别加入19.9 mg、28.4 mg、36.9 mg的葡萄糖对照品各三份，按2.2制备多糖溶液，按2.2.3项显色方法操作测定总多糖含量，结果平均加样回收率为98.8%，RSD值为1.10%，表明该测定方法可靠，结果见表5。

表4 稳定性实验结果

表5 加样回收率实验结果

2.4 PLP的提取工艺研究

以多糖提取率为指标，首先通过单因素试验考察提取温度、提取时间和提取次数对PLP提取率的影响，然后根据以上单因素试验，选取各因素中较优的3个水平，采用L9（33）正交表进行正交试验设计，从而选出荜茇多糖提取的最佳工艺条件。

2.5 单因素试验

2.5.1 提取温度对PLP提取率的影响

称取荜茇5 g，在提取时间为60 min，提取次数为2次的条件下，设置提取温度分别为 60、70、80、90、100℃，按照2.1的步骤进行多糖的提取，然后在波长490 nm处测定多糖溶液的吸光度，根据回归方程计算多糖溶液的浓度，得出荜茇多糖的提取率。

2.5.2 提取时间对PLP提取率的影响

称取荜茇5 g，在提取温度为100℃、提取次数为2次的条件下，设置提取时间分别为 40、60、80、100、120 min，按照2.1的步骤进行多糖的提取，然后在波长490 nm处测定多糖溶液的吸光度，根据回归方程计算多糖溶液的浓度，得出荜茇多糖的提取率。

2.5.3 提取次数对PLP提取率的影响

称取荜茇5 g，在提取温度为100℃、提取时间为60 min的条件下，分别提取1、2、3、4、5次，按照2.1的步骤进行多糖的提取，然后在波长490 nm处测定多糖溶液的吸光度，根据回归方程计算多糖溶液的浓度，得出荜茇多糖的提取率。

2.6 正交试验

以单因素试验的结果为基础，采用L9（33）正交表进行正交试验设计，考察提取温度（A）、提取时间（B）和提取次数（C）三个因素，选取各因素中较优的3个水平。

2.7 PLP脱蛋白

荜茇多糖浓缩溶液采用Sevage法[9]去除蛋白质、核酸等杂质，常温下离心10 min，然后取上清液重复操作5次，直到用紫外检测在波长260-280 nm处无明显吸收峰为止[10]。最后，将脱蛋白后的多糖溶液按照1∶2的比例加入乙醇溶液（95%），静置24小时，抽滤，用无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤沉淀，烘干后得到初步纯化的荜茇多糖，即脱蛋白后的PLP。

2.8 抗氧化活性研究

许多中蒙药多糖均具有抗氧化活性，可以增强免疫功能并延缓机体衰老[11]，机体内自由基具有很强的氧化反应能力，可与大多数的无机物和有机物发生多种类型的反应，致细胞突变并坏死，因此多糖的清除自由基能力是评价其抗氧化活性的一个重要方面[12-14]。

2.8.1 ABTS自由基清除试验

ABTS溶解在0.01 mol/L磷酸缓冲溶液（pH=7.4）配成7.4 mmol/L的溶液，然后取2 ml上述ABTS溶液与2 ml的2.45 mmol/L过硫酸钾溶液，将混合物放在室温下黑暗中16 h。稀释ABTS溶液使其吸光度控制在0.7±0.02的范围内（734 nm处测吸光度）并且在30℃恒温30 min[15]，每个样品取2 ml（浓度分别为0.06、0.12、0.24、0.48、0.96、1.92 mg/ml）与2mlABTS溶液混合，在室温下反应20 min，立即在734 nm处测吸光度并记录。每个样品重复测3次并求平均值，VC用做标准，。按照下列公式分别计算荜茇多糖与VC对ABTS自由基的清除率，公式如下：

ABTS自由基的清除率（%）={1-（A2-A1）/A0}×100%

式中，A0为2 ml ABTS溶液+2 ml蒸馏水的吸光度值；A1为2 ml磷酸缓冲溶液+2 ml荜茇多糖溶液吸光度值；A2为2 ml ABTS溶液+2 ml荜茇多糖溶液吸光度值。

2.8.2 DPPH自由基清除试验

DPPH：用95%乙醇配置成0.2 mmol/L的溶液。

每个样品取 2 ml(浓度分别为 0.06、0.12、0.24、0.48、0.96、1.92 mg/ml)与2 ml DPPH溶液混合，室温下混合30 min，吸光度在517 nm处测量，VC用做标准，每个样品重复测3次并求平均值。按照下列公式分别计算荜茇多糖与VC对DPPH自由基的清除率：

DPPH自由基的清除率（%）={1-（A2-A1）/A0}×100%

式中，A0为2 ml DPPH溶液+2 ml蒸馏水的吸光度值；A1为2 ml乙醇+2 ml荜茇多糖溶液吸光度值；A2为2 ml DPPH溶液+2ml荜茇多糖溶液吸光度值[16]。

3 结果与分析

3.1 PLP含量的测定

葡萄糖标准曲线的回归方程为A=10.366C+0.011（n=6，r=0.9996），式中C为葡萄糖标准溶液的浓度，A为葡萄糖在490 nm波长处测定的吸光值。结果显示葡萄糖溶液浓度在0.0100-0.0602 mg·mL-1范围内具有良好的线性关系。

3.2 单因素试验结果分析

荜茇多糖的提取率随提取时间的增长而增大，提取时间小于60 min时提取率增幅缓慢，大于60 min增幅明显，为了更准确地考察提取时间对PLP提取率的影响，在正交试验中选择提取时间分别为80、100、120 min作为考察水平进行进一步优化。

荜茇多糖的提取率随温度的升高而增大，在提取温度为100℃时，提取率最高；温度从60℃增至70℃时，多糖的提取率没有明显提高，但温度大于70℃提取率明显提高很多，结果表明温度对多糖的提取率影响较大，所以选择提取温度分别为80、90、100℃作为考察水平进行正交试验。

荜茇多糖的提取率随提取次数的增加而增大，当提取次数大于4时，多糖提取接近完全，当提取次数增加到5时，提取率变化不大，增加趋势减缓，从经济角度综合考虑，选择提取次数分别为2、3、4次作为考察水平进行正交试验。

3.3 正交试验结果分析

3.3.1 正交试验结果

为了确定PLP的最佳工艺条件，根据以上单因素试验，采用L9（33）正交表，以提取时间，提取温度，提取次数三个因素，选取各因素中较优的3个水平，见表6。

提取时间（80、100、120）分钟，提取温度（80、90、100）℃，提取次数（2、3、4）次，做正交试验。见表7和表8。

图1 葡萄糖标准曲线

表6 L9（33）因素水平表

表7 正交试验设计表及结果

表8 方差分析

由正交试验结果（表7）可知，影响荜茇多糖提取率的诸因素的主次关系依次是提取温度（B），提取时间（A），提取次数（C）；从表7可以直观的辨别各因素的最佳组合为A3B3C2，即最佳工艺为提取时间120分钟，提取温度100℃，提取次数3次。

3.3.2 验证试验

在最佳工艺条件下进行荜茇多糖提取的验证试验，结果见下表：

表9 荜茇中多糖含量的测定结果

图2 PLP与VC对ABTS自由基清除率

图3 PLP与VC对DPPH自由基清除率

如表9所示，采用最佳提取方法提取荜茇多糖，粗多糖平均提取率为1.21%，而且RSD值仅为1.7%，三次结果差异很小，说明该工艺稳定可行。

3.4 脱蛋白后PLP对ABTS自由基的清除结果

如图2所示，荜茇多糖浓度在0.06mg⋅ml-1时，对ABTS自由基的清除率较低为31.12%，随着多糖浓度升高，对ABTS自由基清除率也增大，当多糖浓度大于0.48mg⋅ml-1时，清除率已达99.71%，多糖浓度继续升高，对ABTS自由基的清除率增加得不再明显，说明抗氧化作用已经接近饱和，当多糖浓度为0.96mg⋅ml-1时，其清除率与VC清除率相同，达到100%。当多糖浓度增加至1.92mg⋅ml-1时，其清除率略有下降为99.42%。

3.5 脱蛋白后PLP对DPPH自由基的清除结果

如图3所示，荜茇多糖对DPPH自由基清除率随多糖浓度先升高后下降，当浓度达到0.48mg⋅ml-1时，清除率最大达到88.27%，接近VC的清除率。但是当多糖浓度增至0.96mg⋅ml-1时，对DPPH自由基的清除率反而降至37.14%，说明由于多糖不溶于乙醇，同时多糖浓度过高，出现多糖析出的现象，导致清除率有所下降。

4 结论

本研究采用正交试验法优化PLP的提取工艺条件，验证试验结果表明，该提取工艺条件稳定可靠，可以为PLP的进一步开发和药理作用研究奠定实验基础。体外抗氧化实验表明，PLP对ABTS自由基的清除能力较高，当PLP浓度不低于0.96 mg/ml时，其清除率与VC清除率相同，而对DPPH自由基的清除能力当PLP浓度超过0.96mg/ml时弱于Vc。总的来说，PLP对于自由基还是具备较好的清除能力，具有良好的抗氧化活性，今后会针对PLP抗氧化活性进行进一步体内研究。