黄芪破壁饮片的DNA条形码鉴别与黄酮类成分HPLC指纹图谱研究＊

王 艳，彭丽华，郑夏生，成金乐＊＊

（1.广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心，岭南中药资源教育部重点实验室（广州中医药大学），国家中成药工程技术研究中心南药研发实验室 广州 510006；2.国家中医药管理局中药破壁饮片技术与应用重点研究室，中山市中智药业集团有限公司 中山 528437；3.广州中医药大学 广州 510006）

《中国药典》2015年版收载的药用黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根[1]。具补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌的作用[2]。其主要有效成分为黄酮类、皂苷类、多糖类等。

中药破壁饮片是通过现代粉碎技术将传统中药饮片加工至D90＜45 μm（300目以上）的破壁粉体，进而通过无添加成型技术制成的30～100目的干燥颗粒状饮片[3]。中药破壁饮片与传统饮片相比，具有全成分入药、均匀性好、利用率高、服用简单、便携的特点，经过细胞破壁后破壁草本的有效物质溶出率更高[4]，临床上也得到越来越多人的关注。但同时，破壁之后失去了绝大多数药材的原有性状特征，增加了其物种鉴定的难度，DNA条形码技术从基因水平对物种进行鉴定，为中药破壁饮片真伪鉴定提供有效手段。此外，研究表明，黄芪中黄酮类成分具有清除氧自由基，抑制脂质过氧化和维持血中一氧化氮浓度，保护缺血再灌注损伤的作用[5]。有文献报道[6]，通过黄芪提取物抗疲劳作用的比较，得出黄芪中黄酮类成分的药效最佳。同时通过不同产地黄芪总黄酮HPLC指纹图谱研究[7]表明不同产地之间黄芪的质量存在很大的差异。本实验采用了DNA条形码技术，选用ITS2为主体序列，psb A-trn H为辅助序列[8]对产地为甘肃的黄芪药材制成的黄芪破壁饮片进行了物种鉴定，同时建立了2015版药典中蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao破壁饮片黄酮类成分HPLC指纹图谱，为黄芪破壁饮片的质量控制提供了有效的方法。本文通过DNA条形码、HPLC指纹图谱两种方法相结合，在真伪鉴别的前提下，对15批黄芪破壁饮片进行质量分析，再通过指纹图谱相似度比较，对黄芪破壁饮片的真伪与批间一致性进行综合评价。

1 材料与仪器

1.1 药物及试剂

1.1.1 受试药物

15批黄芪原药材购自甘肃岷县顺兴和中药材有限公司，均由中山市中智药业集团有限公司制备成15批黄芪破壁饮片，批号：20170601(S1)、20170602(S2)、20170701(S3)、20170702(S4)、20170703(S5)、20170704(S6)、20170705(S7)、20170706(S8)、20170707(S9)、20170708(S10)、20170709(S11)、20170801(S12)、20170802(S13)、20170803(S14)、20170804(S15)。

1.1.2 对照品

毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（中国食品药品检定研究院）、芒柄花素（中国食品药品检定研究院）、毛蕊异黄酮（成都曼斯特生物科技有限公司）、刺芒柄花苷（成都曼斯特生物科技有限公司）。

1.1.3 试剂

甲醇（OCEANPAK）、乙腈（Merck KGaA）为色谱纯；水为超纯水；其他试剂为分析纯。植物基因组DNA提取试剂盒（百泰克，DP3111）；2×Power Taq PCR Master Mix（百泰克，PR1701）

1.2 仪器

生物样品均质仪（爱施德，Bioprep-24）、低温冰箱（Eppendorf，5430R）；多功能 PCR 仪（Biometra，Flex Cycler 2）；水平电泳仪（Bio-Rad）；凝胶成像仪（Biometra，BDA digital）。高效液相色谱仪（Thermo Fisher，U3000）；明澈TM-D24UV纯水系统；KQ-400KOE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电热恒温水浴锅DK-S24（上海森信实验仪器有限公司）；万分之一电子天平AB204-S（METTLER TOLEOD）、十万分之一电子天平AUW220D（岛津公司）。

2 实验方法

2.1 DNA条形码方法

2.1.1 样品前处理

分别称取各样品50 mg，置于陶瓷研钵中，用力研磨，取粉末用于DNA提取。

2.1.2 DNA提取

试剂盒法：按照新型快速植物基因组DNA提取试剂盒（百泰克，DP3111）说明书操作。

2.1.3 PCR扩增和测序[9]

PCR反应体系：2×Power Taq PCR Master Mix（百泰克，PR1701）12.5 μL，正反向引物：ITS2-2F，ATGCGATACTTGGTGTGAAT；ITS2-3R，GACGCTT-CTCCAGACTACAAT；psbA-trnH 引物：psbA-F，GTTATGCATGAACGTAATGCTC；trnH-R，CGCGCATGGTGGATTCACAATCC各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O补足体积至25.0μL；阴性对照（Negativecontrol，NC）采用ddH2O作为模板。温度程序（ITS2）：94℃，4 min；94℃，30 s，52 ℃，30 s，72 ℃，45 s，35个循环；72 ℃，5 min。温度程序（psbA-trnH）：94 ℃，2 min；94 ℃，30 s，52 ℃，20 s，72℃，50 s，35个循环；72℃，5 min。反应完成后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测各PCR产物，在目的区域出现清晰条带的样品则送检做Sanger测序。

2.1.4 数据处理

将测序所得的原始峰图导入CodonCodeAligner（Version5.1.5.0）进行序列处理，去除5.8SrRNA和28SrRNA区以获得ITS2序列；psbA-trnH片段则仅进行引物区域裁切。将各样品的ITS2序列和psbA-trnH序列作为Quary分别在NCBI、中药材DNA条形码鉴定系统（http：//www.tcmbarcode.cn/china/index.php?optionid=174）上做比对，取同源性最高的比对结果。

2.2 指纹图谱方法

2.2.1 提取溶剂的考察

取黄芪破壁饮片（批号：20170705）3 g，精密称定，精密加入甲醇、乙醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇20 mL，静置30 min，超声40 min，摇匀，过滤，续滤液再经过0.22 μm微孔滤膜滤过，进样10 μL，结果表明，用甲醇提取所测得的各主要峰峰面积之和最大，因此，选择纯甲醇作为黄芪破壁饮片的提取溶剂。

2.2.2 提取方法的考察

取黄芪破壁饮片（批号：20170705）3 g，精密称定，精密加入甲醇20 mL，静置30 min，比较回流提取、超声提取等提取方法的提取效果结果表明，回流提取和超声提取方法的提取效果相差不大，但考虑到实验操作的简便性，故选取了超声提取。

2.2.3 供试品溶液的制备

取黄芪破壁饮片3 g，精密称定，加甲醇20 mL，静置30 min，超声40 min，摇匀，过滤，续滤液再经过0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.2.4 检测条件的确定

2.2.4.1 检测波长的选择

用十八烷基硅胶为填充剂，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（B）-0.15%甲酸水溶液（A），按照程序梯度洗脱：0-10 min，5%-30%(B)；10-30 min，30%(B)；30 min-50min，30%-60%(B)；50min-52min，60%-5%(B)；52min-60 min，5%(B)；柱温：25℃；体积流量：0.6mg⋅ml-1；进样量：10 μL。在选择检测波长过程中，采用全波长扫描，图谱显示在254 nm处样品出峰数多，各主要峰面积面积之和较大，故选254 nm作为检测波长。

2.2.4.2 流动相的确定

用十八烷基硅胶为填充剂，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为①甲醇-水②乙腈-水③乙腈-0.1%甲酸水溶液④乙腈-0.15%甲酸水溶液⑤乙腈-0.2%甲酸水溶液⑥乙腈-0.1%磷酸水溶液⑦乙腈-0.1%乙酸水溶液梯度洗脱。柱温：25℃；体积流量：0.6mg⋅ml-1；进样量：10 μL。比较各流动相下图谱的分离度和半峰宽，结果选取④号系统为流动相。

2.2.5 方法学考察

2.2.5.1 精密度试验

取同一黄芪破壁饮片供试品（批号：20170705），照上述色谱条件与系统适应性试验项下方法，连续进样6次，各图谱的相似度均在0.99以上，表明仪器等整个检测系统的精密度良好。

2.2.5.2 稳定性试验

取黄芪破壁饮片供试品溶液（批号：20170705），分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、18 h、24 h测定，各图谱相似度均在0.99以上，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.5.3 重复性试验

取黄芪破壁饮片（批号：20170705）3 g，共6份，分别依法制成供试品溶液，照上述色谱条件与系统适应性试验项下方法，分别进样，各图谱相似度均在0.99以上，表明该方法的重现性良好。

图1 15个样品ITS2扩增结果

图2 15个样品psbA-trnH扩增结果

3 实验结果

3.1 DNA条形码实验结果及分析

3.1.1 ITS2片段及psbA-trnH片段扩增结果

15批黄芪破壁饮片均能成功提取出基因组DNA，并可成功获得ITS2片段及psbA-trnH片段（见图1、2）

3.1.2 ITS2鉴定结果

利用ITS2片段可以成功鉴定出本研究中的15批黄芪破壁饮片，其各批次之间的碱基均一致，各样品的ITS2序列比对结果与公共数据库中蒙古黄芪已有序列的同源性达到100%（见表1），ITS2序列比对过程中未出现除蒙古黄芪同源性达到100%的其他物种。

3.1.3 psbA-trnH鉴定结果

比对结果表明，各批次样品之间的序列一致，各样品中的psbA-trnH序列比对结果与公共数据库中蒙古黄芪已有序列的同源性均达到100%（见表2），psbA-trnH序列比对过程中未出现除蒙古黄芪同源性达到100%的其他物种。

3.1.4 结果分析

ITS2及psbA-trnH鉴定结果显示，实验所用的黄芪为蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao。

表1 ITS2序列比对结果

表2 psbA-trnH序列比对结果

3.2 HPLC指纹图谱实验结果及分析

3.2.1 指纹图谱的建立

取15批黄芪破壁饮片供试品溶液各10 μL，在上述色谱条件下进行测定，得到15批不同批次黄芪破壁饮片HPLC指纹图谱，根据色谱图中各色谱峰的相对保留时间，确定共有峰，并选取其中11个共有峰作为特征指纹峰，建立的指纹图谱见图3（S1～S15分别对应上述样品批次名称）。

3.2.2 共有峰的标定

图3 15批不同批次黄芪破壁饮片HPLC指纹图谱及对照图

根据15批黄芪破壁饮片的指纹图谱检测结果，选择图谱中峰面积较大、峰形较好的色谱峰为共有峰，在对照图谱上共标定11个共有峰。经过与对照品比对知5号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，7号峰为刺芒柄花苷，10号峰为毛蕊异黄酮，11号峰为芒柄花素，见图4。计算各色谱峰保留时间和保留峰面积与同一图谱中S峰的保留时间和保留峰面积比值，得到的相对保留时间和相对峰面积见表4及表5。

3.2.3 共有峰相关信息

色谱图中5号色谱峰（毛蕊异黄酮葡萄糖苷）分离度良好，保留时间适宜，故选此峰为参照峰。根据15批黄芪破壁饮片样品的色谱图结果，以参照峰峰面积为基准，计算各保留时间与参照峰的保留时间，各共有峰与参照峰峰面积的比值，RSD值在0.024%-0.116%之间，相对保留时间稳定，符合《中药注射剂指纹图谱的技术要求（暂行规定）》的要求（结果见表3，表4）。

3.2.4 15批黄芪破壁饮片指纹图谱相似度评价

对15批不同批次黄芪破壁饮片的HPLC数据进行处理，与对照指纹图谱相匹配，15批不同批次黄芪破壁饮片的HPLC谱图的相似度在0.9-1.0之间。表明各批样品来源均一，质量稳定（表3，表4）。

4 讨论

对于已失去外观形状的黄芪破壁饮片，本研究通过DNA条形码技术对实验所用的15批样品进行物种鉴定，结果显示样品均为2015年版药典中的蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao。以单一的有效成分控制中药质量已不能适应中药现代化的形势，中药指纹图谱可以在不清楚全体化学成分的情况下，有效控制中药的内在质量，提高中药质量的稳定性[10]。因此本研究在基源确定后对15批黄芪破壁饮片黄酮类成分进行指纹图谱研究，方法学考察结果符合指纹图谱技术要求，并对图谱进行相似度评价，结果各批次的相似度均大于0.9，表明所用的样品质量稳定，来源均一。

中药破壁饮片是一类创新型饮片，目前对黄芪破壁饮片质量评价的方法鲜有报道。药材的打破细胞壁后失去原有的显微及外观特征；但却具有节省药材、免煎高效等优点。近年来，越来越多的药理药效学研究结果表明中药破壁饮片相对于传统饮片具有更好的安全性和有效性[11-14]。本文的研究则是从质量控制方面做出了有意义的探究—利用DNA条形码技术进行黄芪破壁饮片的物种鉴定，再在物种鉴定的基础上通过HPLC指纹图谱技术评价黄芪破壁饮片的质量。辛天怡等[15]提到DNA容易降解，在进行DNA条形码鉴定过程中，可能会由于DNA降解过于严重而无法成功获得其条形码序列，采用DNA条形码技术和与其他方法结合进行检验，综合评价药品质量更具有说服力。本实验采用DNA条形码技术结合HPLC指纹图谱技术同时评价黄芪破壁饮片的质量，对于生产实践具有重要的指导意义，同时保证产业化的产品质量，为保证产品批间一致性提供了可行性的方法。

图4 黄芪破壁饮片指纹图谱与混合对照品HPLC图

2015年版药典中黄芪药材有2种来源，即蒙古黄芪、膜荚黄芪。这2种来源的黄芪质量具有一定的差异，本实验只对来源为蒙古黄芪药材所制成的黄芪破壁饮片进行了HPLC指纹图谱的研究，对2种来源黄芪质量上的差异进行系列的研究具有一定的必要性。同时本实验中只收集了甘肃一个产地的不同批次的黄芪药材制成的黄芪破壁饮片进行研究，实验结果显示其质量稳定，对于企业生产上质量控制具有很好的指导意义，但收集蒙古及不同产地的黄芪对比其质量的差异性，为其生产上选择优质的原药材更具实际意义。除此之外也需要在指纹图谱的基础上对其药效学进行深入研究，为临床用药提供科学的依据。

表3 15批黄芪破壁饮片指纹图谱共有峰相对保留时间

表4 15批黄芪破壁饮片指纹图谱共有峰相对峰面积

表5 相似度计算数据-平均数

表6 相似度计算数据-中位数