中草药熏香燃烟体外抑菌试验

陶 剑，冯磊磊，张德隆，孟 立，卫恒习，李 莉，张守全

（1.华南农业大学动物科学学院/国家生猪种业工程技术研究中心/广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室，广东 广州 510642；2.新疆农业大学动物科学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

近年来我国的养猪业高速发展，养殖的主要方式已经从传统粗放型的散养模式向集约化、规模化、标准化、专业化方向转变。而规模化养殖场常年不断发生细菌病，细菌的混合感染或者继发性感染是导致猪群的发病率和死亡率增高的重要原因[1]。细菌病的传播多为通过空气传播，杀灭空气和栏舍表面的细菌可有效防治猪病。中药熏香是操作简单、消毒效果好并且经济实惠的有效途径之一。在我国，中药熏香疗法具有悠久的历史并被广泛的应用于临床，防治多种疾病[2]。熏香经燃烧后产生微粒性烟尘，经呼吸道或者皮肤吸入等方式进入体内发挥药效，达到消毒杀菌、增强身体免疫力、促进体内调和能力、驱虫灭蚊等作用[3-4]。有研究表明，中草药熏香剂可以调节大鼠免疫器官、全血T细胞亚群及肺泡灌洗液中 IFN（干扰素）-γ 水平[5]，提高血清 sIgA、IL（白细胞介素）-6水平[6]，增强免疫力。本试验研究了中草药熏香燃烟及其溶解物抑制金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、嗜水气单胞菌的活性，为利用中草药熏香防控猪病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2017年6—8月在华南农业大学动物科学学院/国家生猪种业工程技术研究中心/广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室进行。

1.2 材料

中草药熏香由广东天地本草饲料科技股份有限公司提供，其主要成分包括艾草、苍术、五倍子、芡实、玉竹等10数种中草药。标准菌株：金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、沙门氏菌。M-H培养基购置于青岛高科园海博生物技术有限公司，定性滤纸购置于杭州沃华滤纸有限公司，100 mm培养皿、0.45 μm、0.22 μm 过滤器等均购置于广州佳妍生物有限公司。

1.3 中草药熏香燃烟提取物

准确称量熏香，以3倍的超纯水或75%乙醇溶解燃烟。以1 g熏香完全燃尽通过溶解装置并溶解于1 mL相应的溶剂作为熏香1 g/mL的生药浓度。点燃熏香，放入大锥形瓶中，泵入空气通过集气瓶洗气装置溶解烟雾，合并3个集气瓶的溶液，60℃烘箱浓缩成熏香生药浓度10 g/mL的溶液。分别用超纯水和75%乙醇吸收浓缩得到水溶解物和乙醇溶解物，水溶解物烘干后用二甲基亚砜（DMSO）溶解得到DMSO溶解物，乙醇溶解物干燥除去乙醇后用DMSO重溶解得到乙醇-DMSO溶解物；0.22 μm过滤除菌后，4℃冰箱保存备用。

1.4 药敏试纸

用6 mm打孔器将定性滤纸打成6 mm圆形纸片，高温高压灭菌，烘干。在超净台中用移液枪吸取2.5 μL的提取液滴加到无菌滤纸片上，自然风干，重复10次得到药敏试纸，4℃保存备用。

1.5 菌液制备

在超净工作台中将金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、嗜水气单胞菌接种到LB琼脂培养基平板上，置于37℃恒温箱中培养12 h，挑取单克隆接种到无菌LB培养基中200 r/min、37℃摇菌6～8 h，然后用LB培养基配置成0.5麦氏比浊浓度（相当于1.5×108cfu/mL细菌浓度），再稀释成1.0×106cfu/mL的菌液作初筛和测定最小抑菌浓度（MIC）用，现配现用。

1.6 滤纸片法测定抑菌圈直径

在超净工作台上将高温高压灭菌后的M-H琼脂培养基倒入无菌培养皿中，每皿15～20 mL。待冷却凝固后，吸取200 μL稀释10倍的菌液（相当于1.5×107cfu/mL）滴加到平皿上并均匀涂布。再用无菌镊子夹取各药敏试纸放到含菌培养基表面、37℃培养48 h，每组重复3次。用游标卡尺测量抑菌圈的直径，重复测量3次。

1.7 最小抑菌浓度MIC的确定

取无菌96孔板，每排加入100 μL培养基，然后在第2孔加入100 μL提取液，充分混匀后取出100 μL移至第3孔中，以此类推倍比稀释至第11孔，混匀后弃掉100 μL。每排第1孔至加培养基作为阴性对照，第2孔起加入100 μL菌液（浓度1.0×106cfu/mL），第12孔不加提取液作为阳性对照，37℃培养18 h后观察，以培养基清澈的最低浓度为抑菌浓度。

1.8 菌落计数法模拟现场杀菌作用

在超净工作台中用LB培养基将0.5麦氏比浊浓度的菌液（相当于1.5×108cfu/mL细菌浓度）稀释105倍，吸取100 μL菌液均匀涂布在100 mm无菌M-H琼脂培养基上。在超净工作台中点燃中草药熏香，待产生均匀稳定的烟雾后，将涂布好的平板开盖倒扣在烟雾上方约30 cm处，分别停留0 min、1 min、5 min、10 min、30 min、60 min，结束后 37 ℃培养 12 h，每组重复3次，观察记录不同时间的菌斑数。

1.9 统计分析

用SPSS Statistics 19.0软件中的单因素方差分析进行数据统计分析，试验数据以平均数±标准误表示，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 熏香燃烟水溶解物和不同溶解物的抑菌圈结果

熏香燃烟不同溶解物对5种菌的抑菌大小如表1所示。其中，乙醇-DMSO溶解物对5种菌的抑菌圈直径最大，抑菌效果最好，对大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌的抑菌圈直径分别为（11.95±0.40）mm、（7.19±0.08）mm、（7.13±0.13）mm、（8.78±0.26）mm、（12.54±0.19）mm；而水-DMSO溶解物对大肠杆菌和嗜水气单胞菌的效果次之，水溶解物抑菌圈直径最小。而对于沙门氏菌、链球菌和金黄色葡萄球菌，水溶解物的抑菌圈直径则大于水-DMSO溶解物。

表1 熏香燃烟不同溶解物对5种细菌抑菌圈直径的初筛结果 mm

2.2 熏香燃烟水溶解物和不同溶解物对细菌的MIC

采用微量稀释法分别测定熏香不同溶解物对5种细菌的MIC，结果如表2所示。乙醇-DMSO溶解物对5种细菌最为敏感，抑菌浓度最低，其次为水-DMSO溶解物，最次水溶解物。各溶解物对金黄色葡萄球菌和嗜水气单胞菌的抑菌效果最好，尤以乙醇-DMSO溶解物的MIC最小，分别为39.1 mg/mL和78.1 mg/mL。

表2 熏香燃烟不同溶解物对5种细菌的MIC mg/mL

2.3 熏香对不同细菌模拟现场杀菌作用

熏香经模拟现场杀菌试验测试，结果如表3、表4所示，经过10～30 min的烟熏，可以完全杀灭涂布在平板上的5种细菌。其中以对嗜水气单胞菌的效果最好，烟熏1 min的灭菌率为（29±1）%，烟熏5 min之后已能全部杀灭；其次为链球菌和大肠杆菌，烟熏10 min后平板上分别还有（6.33±4.10）cfu和（7.33±0.33）cfu，灭菌率分别为（94±4）%和（97±0）%。而对金黄色葡萄糖球菌和沙门氏菌则需要更长时间的烟熏才能达到杀菌作用。

表3 熏香对不同细菌模拟现场杀菌作用

表4 熏香对不同细菌模拟现场的杀菌率

3 讨论

现代养殖场是疾病的重灾区和细菌污染源，疾病的防治是养殖场的重要环节。杀灭空气中病菌是防治疾病的有效手段之一。猪场内常用的杀菌方式有化学消毒剂杀菌和物理方式杀菌，然而常规的化学消毒剂消毒均存在不同的毒性[7]，对猪群和人员有一定的副作用，而物理杀菌方式主要是紫外线灯杀菌，此法易引起皮肤红斑、刺激眼结膜[8]，并且紫外线穿透力小，存在杀菌盲区，消毒不彻底。中草药熏香源于野生植物，具有很高的安全性[9]，燃烧产生烟气可以散发到整个空间，杀菌驱蚊彻底无死角，甚至在不关闭门窗时也能达到良好的效果，所产生的芳香性烟雾对皮肤、黏膜以及呼吸道无刺激，同时能达到止咳平喘、预防流行性感冒、增强免疫力等功效[8]。

艾草中含有桉油素、β-石竹烯、α-萜品烯醇以及芳樟醇等有效活性物质，因此具有杀灭螨虫、驱除蚊子、苍蝇、蟑螂、蚂蚁等功效以及对大肠杆菌、变形杆菌、肠炎膜杆菌、葡萄球菌、酿酒酵母菌、白色念球菌、黑曲霉菌等有很好的抗菌活性。姚勇芳等[10]研究表明，艾草的水提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有较好的抑菌效果，而对霉菌抑制效果不明显。陈羽等[11]发现艾叶提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白假丝酵母菌和黑曲霉均起到了显著的杀菌作用。刘巍等[12]考察了艾叶水提液对常见妇科致病菌的抑制作用，发现艾叶水提液对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等5种常见致病菌均有明显的抑制作用。尹璐等[13]研究表明，苍术具有广谱抗菌作用，对大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌和酵母菌等4种菌均具有较好的抑制作用。张霞等[14]研究表明，五倍子对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都具有有效的抑菌效果，其浸出物的最小抑菌浓度分别为12.5 mg/mL和6.25 mg/mL，并且50 mg/mL的五倍子浸提物的抑菌效果相当于2.5 mg/mL的青霉素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果，可能是其中含有鞣酸的缘故。

本试验研究了熏香燃烟及燃烟溶解物对5种常见细菌的抑制作用，结果表明该熏香燃烟对金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、嗜水气单胞菌都有一定的抑制作用，而对金黄色葡萄球菌和嗜水气单胞菌的抑制作用较好，可能是因为其中的艾草含有的抑菌物质对其有较好的抑制作用，这与卢学根的研究结果相近[10]。但抑菌圈直径较小，最大抑菌圈直径也仅有12.5 mm，MIC试验也表明需要较高的浓度才能达到抑菌作用。可能是因为熏香中抑菌物质的热稳定性较差[15]，经过燃烧后产生的燃烟中有效成分含量较低或者被水或乙醇的吸收量较少，导致有效成分的浓度较低的缘故。

4 结论

熏香燃烟的乙醇-DMSO溶解物的抑菌效果最好，尤其是对嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌的敏感程度较高，其次为水-DMSO溶解物，最次为水提取物。而直接用熏香燃烟熏10～30 min后都可以达到很好的熏灭效果，尤其对嗜水气单胞菌、大肠杆菌、链球菌的熏灭效果最佳。