猪流行性腹泻病毒安徽分离株ORF3基因的克隆与序列分析

潘孝成，沈学怀，赵瑞宏，胡晓苗，戴 银，周学利，侯宏艳，张丹俊

（安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽 合肥 230031）

猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）属于冠状病毒科冠状病毒属，为单股正链有囊膜的RNA病毒，其可导致猪的一种以水样腹泻、呕吐和脱水为特征的传染病。1971年首次在英国发现猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）[1]，我国内地自20世纪80年代初以来陆续有关于PEDV分离和鉴定的报道[2]。2010年底开始，PED在我国呈暴发性流行，流行面较广，主要表现为各年龄段猪均可发生腹泻，成年猪一般只表现为腹泻症状，小猪死亡率高，10日龄仔猪死亡率可达100%，给众多养猪场（户）带来了巨大的经济损失[3-4]。PEDVORF3基因由675个核苷酸组成，编码224个氨基酸，是一种非结构蛋白。研究表明ORF3基因与PEDV的毒力相关[5]。本研究对PEDV安徽分离株的ORF3基因进行了PCR扩增和序列分析，以期为PED的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、材料

RNAiso Plus试剂、反转录试剂盒、Taq酶、pMD-18T载体等购自TakaRa公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒、DH5α、DNA Marker等购自生工生物工程（上海）股份有限公司。猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪轮状病毒（PoRV）的抗原快速检测试剂盒（胶体金试剂）购自BioNote公司。

1.2 病料

病料样品为刮取的肠道黏膜，采自安徽省境内疑似发生猪流行性腹泻的猪场（2013年12月至2014年6月），发病仔猪临床表现为水样腹泻，肠道出血，用PEDV、TGEV和PoRV的胶体金抗原快速检测试剂盒检测，结果为PEDV阳性，TGEV和PoRV均为阴性。从胶体金试剂检测为PEDV阳性的样品中，选择了不同地区8个有代表性的猪场样品进行试验，这8个猪场分别来自肥东县、广德县、合肥市包河区、和县、寿县、六安市金安区、利辛县、定远县。

1.3 引物合成

根据GenBank中已发表的PEDV的ORF3基因序列，设计了 1 对引物，P1（5'-3'）：AAGGTCCACG TGCAGTGATGT，P2（5'-3'）：TACTAGACCATTATCA TTCAC，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。扩增705 bp基因片段长度，包含PEDVORF3基因全长。

1.4RNA提取及cDNA合成

刮取发病仔猪小肠黏膜层，按TakaRa公司RNAiso Plus试剂盒说明书提取总RNA，用TakaRa公司1st Strand cDNA Synthesis kit进行反转录合成cDNA，-20℃保存备用。

1.5 PCR扩增

以合成的cDNA为模板，用引物对P1/P2进行PCR 扩增，扩增体系为：cDNA 3 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，上下游引物（P1/P2）各 1 μL（10 pmol/μL），Ex-Taq 酶 0.5 μL，ddH2O 15 μL。扩增条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，50 ℃50 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸 10 min。电泳鉴定为阳性的PCR产物，按照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书对PCR产物进行回收，连接pMD-18T载体，转入DH5α，鉴定的阳性质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.6 基因序列分析

采用 DNA Star、DNAMAN、Genetyx 等软件，将扩增序列与GenBank中的13个PEDV分离株的ORF3基因序列进行序列比对、同源性分析和遗传进化分析。所用参考毒株序列见表1。

表1 参考株相关信息

2 结果

2.1 RT-PCR扩增结果

取猪流行性腹泻病毒胶体金抗原检测试剂检测为阳性的，且来自安徽省不同地区8个猪场的样品进行PCR扩增，电泳结果显示，扩增的基因片段大小均约为705 bp（图1），与预期结果相符。

图1 PEDV ORF3基因的PCR扩增结果

2.2 基因测序与同源性分析

经测序，证实获得了包含8个猪流行性腹泻病毒分离株ORF3基因全长的序列，ORF3基因全长均为675 bp，编码224个氨基酸，分别命名为AH-FD、AH-GD、AH-SD、AH-HX、AH-SH、AH-LA、AHYD、AH-FX，其中 AH-FD、AH-GD、AH-SD 和 AHHX 为 2013年流行株，AH-SH、AH-LA、AH-YD 和AH-FX为2014年流行株。应用DNA Star等软件，将8个猪流行性腹泻病毒分离株及参考毒株的ORF3序列进行核苷酸同源性分析，结果显示，8个猪流行性腹泻病毒分离株的ORF3序列同源性为98.5%～100%，其中AH-GD和AH-FD及AH-HX和AH-SH的基因核苷酸序列完全相同（数据未列出），后面只分析6个分离株（AH-FD、AH-SD、AHSH、AH-LA、AH-YD和 AH-FX）的ORF3基因。本研究获得的6个猪流行性腹泻病毒分离株与attenuated DR13、CH-BJ-2011 truncated、CV777、LZC、CHS-2009的同源性相对较低，分别为97.4%～98.1%、97.0%～97.6%、96.4%～97.0%、95.1%～95.7%和97.8%～98.7%，同源性最低的是AH-FX和LZC（95.1%）；与 AH2012、CH-HNZMD-2015、CH-JXJA-2017、MN-2013-USA、SC-CD-2015、SCDY-2016、USA-OK10240-6-2017和ZJU-G2-2013的同源性相对较高，分别为98.2%～99.7%、98.7%～99.6%、98.8%～99.9%、99.0%～100%、99.1%～99.7%、98.8%～99.9%和99.1%～99.6%，同源性最高的是AH-LA和2013年美国分离株MN-2013-USA（100%），详见图2。

图2 PEDV ORF3基因的核苷酸序列同源性比较

2.3 序列进化分析

通过对6个分离株（AH-FD、AH-SD、AH-SH、AH-LA、AH-YD 和 AH-FX）与参考毒株（CV777、AH2012、LZC、attenuated DR13、MN-2013-USA）的ORF3基因氨基酸序列比对发现，这6个分离株的ORF3氨基酸序列与MN-2013-USA和AH2012高度相似，仅存在0～4个氨基酸不同，其中AH-FD、AH-SD和AH-LA与MN-2013-USA的氨基酸序列相同；与疫苗毒attenuated DR13相比，在81～82位，多了17个氨基酸；与LZC和CV777差异较大，存在7～13个氨基酸不同，具体见图3。

基于ORF3基因的核苷酸序列构建的遗传进化树结果显示（图4），PEDV毒株可分为3大群，Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅲ群，Ⅰ群包括CV777和LZC；Ⅱ群包括CHBJ-2011 truncated和attenuated DR13，Ⅲ群包括本研究得到的6个安徽分离株、2009年我国分离的CHS-2009以及2012年以来我国的6个分离株（AH2012、CH-HNZMD-2015、CH-JXJA-2017、SC-CD-2015、SCDY-2016和ZJU-G2-2013）和美国的两个分离株（MN-2013-USA和 USA-OK10240-6-2017）。这表明，6个分离株（AH-FD、AH-SD、AH-SH、AH-LA、AH-YD和AH-FX）与疫苗株（CH-BJ-2011 truncated和attenuated DR13）、经典毒株CV777和我国2006年分离株LZC株的亲缘关系较远。

图3 PEDV ORF3氨基酸序列比较

图4 PEDV ORF3基因的核苷酸序列进化树

3 讨论

猪流行性腹泻病毒的ORF3基因是其基因组中的唯一附属基因，基因全长为675 bp，分子量为25.3 kDa，编码非结构蛋白ORF3蛋白，因其位于S蛋白和E蛋白之间，又称为SNE（Spike and Envelope，SNE）蛋白。通过对野生毒株和人工致弱毒株的ORF3序列进行比较分析，发现传代致弱的疫苗株均有51个核苷酸（17个氨基酸）的缺失，因此被认为是毒力相关基因[5-6]。本研究获得了8个PEDV分离株的ORF3基因全长序列，这8个分离株分别是2013年和2014年的安徽流行株，序列比对结果显示，8个PEDV分离株的ORF3核苷酸序列高度同源（同源性为98.5%～100%），且与疫苗株相比均不存在17个氨基酸的缺失；且与参考毒株中2011年后的中国及美国分离株存在较高同源性（98.2%～100%），同源性最高的是AH-LA和2013年美国分离株MN-2013-USA（100%），同源性次高的是AH-LA和CH-JXJA-2017、AH-LA 和 USA-OK10240-6-2017及 AHHX、AH-SH、AH-SD、AH-YD 与 MN-2013-USA（99.9%）；与疫苗株（attenuated DR13、CH-BJ-2011 truncated）及CV777和LZC的同源性较低（95.1%～98.1%）。综上推测，2011年以来中国PEDV流行毒株有相同的毒株来源；2011年至今中国PEDV流行毒株无较大变异；美国的PEDV流行毒株与中国分离株，特别是安徽分离株关系亲密，可能存在相同的毒株来源，这与Huang等[7]的分析相一致。

自2010年冬季我国暴发猪流行性腹泻病以来，该病迅速传遍全国，2013—2014年猪流行性腹泻更是肆虐全球，美国、墨西哥、中国台湾、日本、加拿大、多米尼加共和国、哥伦比亚、秘鲁、韩国、乌克兰等国家和地区也相继报道发生猪流行性腹泻疫情[7-8]，给各国养猪业带来严重灾难，是近年来全球养猪业关注的疫病焦点。由于现有猪流行性腹泻疫苗的免疫效力不足，加之猪场环境及猪舍卫生消毒不彻底，猪流行性腹泻病毒在猪场污染严重，难以清除。因此，猪流行性腹泻已成为猪场的常发病，在天气多变的秋季和寒冷的冬春季节仍将流行[9]。2014年以来，猪流行性腹泻病的疫情一直比较平稳，但仍在一些地区的不少猪场发生，虽然在大多数发病猪场的流行时间较前些年有缩短的趋势、发病的严重程度也有较大降低，可其危害仍不容忽视，需要在养猪生产中给予足够的关注。