HMGB1在创伤引起大鼠肺组织内质网应激中的作用

（南通大学医学院法医学系，江苏 南通 226001）

外伤并发症，如急性肺损伤和外伤性多器官功能障碍综合征引起死亡并非罕见。然而，由于伤者外伤之后可能经历了临床抢救治疗、继发性感染等，致使这类案件的死亡方式或案件性质难以判断。外伤发生后，机体各个器官可继发非特征性的时序性损伤变化，这些变化均属于外伤引起的一系列病理生理过程，揭示这些病理生理变化有助于查明死亡原因，确定案件性质。前期研究[1]已发现大鼠双后肢软组织挤压伤能引起远隔器官损伤，其发生机制可能与创伤引起远隔器官发生氧化应激有关[1-2]。已有研究[3]表明，内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）参与介导急性肺损伤发生。高迁移率族B1（high mobility group B1，HMGB1）蛋白属于典型的损伤相关模式分子，可诱发促炎细胞因子表达上调，是引起实质细胞损伤的关键因素[4]。本研究拟通过复制大鼠双后肢挤压致创伤应激引起的急性肺损伤模型，初步探讨创伤应激引起大鼠肺组织ERS相关蛋白葡萄糖调节蛋白 78（glucose-regulated protein 78，GRP78）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12（caspase-12）、CHOP、肌醇需求酶 1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）以及HMGB1的表达变化，为判断外伤后延迟性死亡案例的死亡性质提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

HMGB1兔抗大鼠多克隆抗体购自Abcam公司，GRP78、caspase-12、CHOP、IRE1α 和 β-actin 兔抗大鼠多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，HRP标记羊抗兔IgG二抗、BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）、苏木素-伊红染液购自上海碧云天生物技术有限公司，HMGB1 抑制剂正丁酸钠（sodium butyrate，SB）购自美国Sigma公司，多聚甲醛、水合氯醛购自国药集团化学试剂有限公司，黏附载玻片购自江苏世泰实验器材有限公司，其余试剂均为国产分析纯。

1.2 急性肺损伤大鼠模型的建立与实验分组

选择健康SD大鼠48只，雌雄不限，体质量约200g，SPF级，由南通大学实验动物中心提供。本实验符合实验动物使用管理的有关规定。

本研究实验分为两个部分。各部分实验中，大鼠随机分配，每组6只。

第一部分实验分为挤压组和体位对照组，其中挤压组分为3个时间点亚组。挤压组大鼠制作急性肺损伤模型：大鼠用10%水合氯醛溶液（4 mL/kg）腹腔注射麻醉，麻醉满意后采取俯卧位，将双后肢固定于自制带槽木板上，于双后肢肌肉丰富处压15 kg标准重物，持续挤压3 h后解压30 min，再挤压30 min、解压30min，其中挤压30min、解压30min共重复3次，最后大鼠解除挤压放置适当时间放血处死。于最后一次解压结束后6 h、18 h和30 h放血处死，分别记录为挤压后6h、18h和30h组。体位对照组大鼠除不给予标准重物挤压双后肢外，麻醉、固定等处理与挤压组相同。预实验结果显示，麻醉大鼠给予仰卧位固定3～6h、解除固定后6～30h不能引起肺组织ERS和明显损伤。因此，体位对照组大鼠于最后一次解压后18 h放血处死。

第二部分实验分为体位对照组、挤压后18h组、HMGB1抑制剂SB组（简称“抑制剂组”）和挤压后18h+抑制剂组。体位对照组和挤压后18h组按照第一部分实验操作；挤压后18 h+抑制剂组于连续挤压3 h后腹腔注射SB 500mg/kg，其余处理与挤压后18h组相同；抑制剂组按照体位对照组操作，于挤压后18h+抑制剂组中相应时间点腹腔注射相同剂量的SB。

1.3 蛋白质印迹法检测蛋白表达

大鼠放血处死后，迅速开胸提取100 mg右肺组织，经液氮冻存后置于-80℃冰箱中保存。按100mg肺组织中加入RIPA中性裂解液1mL［预先复温并含1%苯甲磺酰基氟化物（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）］，于冰上用高压灭菌的眼科剪将大鼠肺组织剪碎，静置10 min后，使用电动组织匀浆器进行匀浆，匀浆完成后，静置30min，随后在4℃下，以12 000×g离心15min，取上清液进行蛋白定量。蛋白定量使用BCA蛋白浓度测定试剂盒，定量后加入5×上样缓冲液，于沸水中煮沸5min，随即置于-80℃冰箱中冻存。对各组蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶电压80V，分离胶电压120V，电泳结束后进行转印，将凝胶上的蛋白转印至PVDF膜上，转印条件为100V 1h。转印结束后，室温下用5%脱脂牛奶对PVDF膜封闭2 h，洗去残余的牛奶后，于孵育盒中加入相应的兔抗大鼠多克隆抗体作为一抗，HMGB1、GRP78、caspase-12、CHOP 和 IRE1α 稀 释比例 为 1∶500 或1∶1000，4℃摇床孵育过夜。次日弃去一抗，TBST洗涤PVDF膜3次，每次10min，随后在孵育盒中孵育相应二抗，室温下孵育1～2h，TBST洗涤PVDF膜3次，每次10min，用增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）法显影，采用Bio-Rad成像系统计算灰度值，以 HMGB1、GRP78、caspase-12、CHOP 和 IRE1α与内参β-actin的灰度值比值表示目的蛋白的相对表达水平。

1.4 组织病理学变化

大鼠放血处死后，迅速开胸提取左肺组织置于4%多聚甲醛溶液中固定24～48h，进行常规石蜡切片制作和HE染色，在生物显微镜下观察肺组织的病理学变化。同时，观察大鼠双后肢大体病理变化。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 创伤应激引起大鼠肺组织相关蛋白的表达变化

2.1.1 HMGB1蛋白

蛋白质印迹法结果显示：体位对照组大鼠肺组织存在一定的HMGB1基础性蛋白表达；与体位对照组比较，挤压后6 h组大鼠肺组织HMGB1蛋白表达明显上调，增加了43.75%（P＜0.05），挤压后 18h组达到高峰，较体位对照组增加了93.75%（P＜0.05），挤压后30 h组表达有所降低但仍明显高于体位对照组（P＜0.05）。 详见图1、表1。

图1 挤压大鼠后肢后不同时间点肺组织HMGB1蛋白的表达变化

表1 挤压大鼠后肢后不同时间点肺组织HMGB1和ERS相关蛋白的相对表达变化 （n=6，±s）

表1 挤压大鼠后肢后不同时间点肺组织HMGB1和ERS相关蛋白的相对表达变化 （n=6，±s）

注：1）与体位对照组比较，P＜0.05；2）与相邻上组比较，P＜0.05

组别 HMGB1 GRP78 caspase-12 CHOP IRE1α体位对照 0.32±0.09 0.46±0.16 0.43±0.10 0.36±0.09 0.45±0.05挤压后 6h 0.46±0.121） 0.78±0.091） 0.64±0.061） 0.52±0.121） 0.73±0.051）挤压后 18h 0.62±0.131）2） 1.10±0.011）2） 0.86±0.101）2） 0.73±0.041）2） 0.48±0.162）挤压后 30h 0.40±0.131）2） 0.74±0.211）2） 0.69±0.101） 0.52±0.121）2） 0.45±0.12

2.1.2 ERS相关蛋白

蛋白质印迹法结果显示：体位对照组大鼠肺组织存在内质网分子伴侣GRP78基础性表达。与体位对照组比较，挤压后大鼠肺组织中GRP78、caspase-12、CHOP和IRE1α蛋白表达均明显上调，其中，GRP78、caspase-12和CHOP蛋白表达在挤压后6 h、18 h组呈时序依赖性上调（P＜0.05），挤压后30h组有所降低但仍明显高于体位对照组（P＜0.05），而IRE1α蛋白表达在挤压后6h组明显上调（P＜0.05），挤压后18h和30h组降低且接近体位对照组水平。详见图2、表1。

2.2 HMGB1介导创伤应激引起的大鼠肺组织ERS相关蛋白的表达变化

与挤压后18h组比较，挤压后18h+抑制剂组大鼠肺组织HMGB1蛋白表达明显降低，下调了45.92%（P＜0.05），GRP78、caspase-12、CHOP 和 IRE1α 蛋白表达分别下调了 28.75%、36.47%、45.45%、29.33%（P＜0.05）。与体位对照组比较，抑制剂组caspase-12表达明显降低（P＜0.05），而 GRP78、CHOP、IRE1α 和HMGB1未见明显变化。与挤压后18 h+抑制剂组比较，抑制剂组前述各指标未见明显变化。详见图3、表2。

图2 挤压大鼠后肢后不同时间点肺组织ERS相关蛋白的表达变化

图3 HMGB1抑制剂SB对大鼠后肢挤压后肺组织ERS相关蛋白表达变化的影响

表2 HMGB1抑制剂SB对大鼠后肢挤压后肺组织ERS相关蛋白表达变化的影响 （n=6，±s）

表2 HMGB1抑制剂SB对大鼠后肢挤压后肺组织ERS相关蛋白表达变化的影响 （n=6，±s）

注：1）与体位对照组比较，P＜0.05；2）与挤压后 18h 组比较，P＜0.05

组别 HMGB1 GRP78 caspase-12 CHOP IRE1α体位对照 0.40±0.10 0.62±0.02 0.68±0.01 0.37±0.08 0.53±0.03挤压后 18h 0.98±0.081） 0.80±0.071） 0.85±0.021） 0.66±0.051） 0.75±0.041）挤压后 18h+抑制剂 0.53±0.082） 0.57±0.072） 0.54±0.051）2） 0.36±0.072） 0.53±0.062）抑制剂 0.48±0.09 0.59±0.09 0.54±0.041） 0.35±0.01 0.56±0.08

2.3 创伤应激引起的大鼠肺组织病理学变化

体位对照组大鼠肺组织结构正常。

挤压组大鼠随着挤压和反复3次间断挤压、解压后，肺组织的病变随时间迁延逐渐加重，肺泡壁增厚，炎症细胞数量增多。与挤压各亚组比较，挤压18h+抑制剂组大鼠肺组织病变明显减轻（如肺泡壁变薄、细胞数量变少），抑制剂组大鼠肺组织呈现轻度病变。详见图4。

2.4 大鼠双后肢挤压伤的病理变化

体位对照组大鼠双后肢、鼠爪大体结构正常。挤压组大鼠双后肢经过3 h标准重物挤压及反复3次间断挤压、解压后，双后肢明显压扁，之后随着时间延长而明显增粗，呈紫红色，横断面切开时切面有清亮的液体流淌。与体位对照组比较，抑制剂组大鼠双后肢无明显变化。与挤压后18h组比较，挤压后18h+抑制剂组大鼠的双后肢病变无明显改变。

3 讨 论

肺是重要的生命器官之一，肺死亡也是人体死亡的重要标志。貌似轻微的局部外伤能够诱发体内过度的全身性炎症反应、氧化应激等成为导致包括肺在内的远隔器官损伤的重要发生机制[1-2，5]。急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征是创伤、烧伤后较为常见的并发症，并成为导致肺死亡发生的主要病理环节。研究外伤后急性肺损伤发生的分子机制，有助于阐明外伤后死亡发生过程中在分子层次上的因果关系链，具有十分重要的意义。本研究的主要发现为创伤应激能启动HMGB1-ERS通路导致急性肺损伤。

GRP78是内质网中重要的分子伴侣，协助内质网中蛋白质折叠和修饰，其表达明显上调是公认的ERS标志[6]；caspase-12和CHOP蛋白是ERS相关细胞凋亡的特异性蛋白[6]；IRE1α为ERS启动后激发的下游信号分子之一[7]。本研究结果显示，连续挤压大鼠双后肢3 h及反复3次间断性短暂的挤压和解压引起了大鼠肺组织 GRP78、caspase-12、CHOP 和 IRE1α 蛋白表达明显上调，说明创伤应激导致了大鼠肺组织ERS。内质网是细胞重要的细胞器，承担着蛋白质合成、加工和修饰，负有蛋白质质量控制功能，也是细胞内Ca2+储存、维持细胞Ca2+内稳态及脂质合成代谢的重要场所。内质网内连核膜、外连细胞膜，成为连接细胞外和细胞核之间信号转导的重要途径。然而，内质网对于细胞内外环境的改变非常敏感。在创伤应激过程中，内质网合成蛋白质过多或加工修饰异常以及转运障碍等均可破坏内质网稳态，导致大量的错误折叠或未折叠蛋白质聚集于内质网腔内，引起ERS[6-7]。杜澍金等[8]研究发现，挤压后肢合并浸水束缚应激能引起大鼠肝组织ERS。小鼠肠道缺血致急性肺损伤模型中，ERS诱导中性粒细胞颗粒释放，可促进急性肺损伤的发生[9]。ERS可能是脂多糖引起的急性肺损伤和肝损伤的重要发病途径[10-11]。 研究[6-7]证实，过度的ERS介导细胞凋亡。本课题组最新研究[12]发现，ERS诱导剂能启动多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1依赖的调节性细胞坏死。在本研究中，挤压大鼠双后肢引起了ERS相关的细胞凋亡关键蛋白caspase-12、CHOP表达上调，表明创伤应激引起了肺组织细胞凋亡。ERS及其介导的细胞死亡可能是创伤应激引起急性肺损伤的分子机制之一。

本研究探讨了创伤应激引起大鼠肺组织ERS的途径，初步揭示HMGB1为创伤应激启动肺组织ERS发生的上游分子。研究发现，创伤应激之后大鼠肺组织HMGB1蛋白表达明显上调，18 h达高峰，之后HMGB1蛋白表达呈现下调趋势。SHIMAZAKI等[5]报道，大鼠双后肢受到挤压结束后3h血液中HMGB1含量达高峰，之后含量逐渐降低。大鼠烫伤延迟复苏后，肺组织HMGB1基因和蛋白表达于伤后8 h开始增高，24h达到峰值[13]。HMGB1表达差异可能与大鼠类型、实验条件不同有关。鉴于HMGB1的来源既有激活免疫细胞的主动释放，又有坏死细胞的被动释放，肺组织HMGB1蛋白表达上调的主要原因可能为受损的肺组织细胞HMGB1释放增多、激活的肺组织巨噬细胞及其他炎症细胞HMGB1被诱导表达增加，受损的肺外其他器官（尤其是遭受挤压和缺血再灌注损伤的大鼠双后肢）释放的HMGB1也可能经过循环到达肺组织。本研究发现：SB抑制了创伤应激诱导的大鼠肺组织HMGB1蛋白表达的上调，同时大鼠肺组织ERS相关蛋白表达明显下调，肺组织病理学变化明显减轻。这表明HMGB1参与介导了创伤应激引起的大鼠肺组织ERS和急性肺损伤。HMGB1是细胞核非组蛋白类蛋白分子，在细胞核中发挥DNA分子伴侣作用，一旦表达明显上调、释放出胞，主要发挥损伤相关模式分子功能，成为放大炎症级联反应信号、启动细胞损伤的重要因素[4]。HMGB1导致细胞和器官损伤的研究早有报道：腹腔注射脂多糖诱导急性肺损伤过程中，NF-κB激活并介导HMGB1表达上调参与急性肺损伤的发生发展过程[14]；使用HMGB1中和抗体可以阻断HMGB1的作用，减轻创伤引起的炎症反应，提高挤压后大鼠的存活率[5，15]。本研究结果显示，创伤应激后大鼠肺组织的主要变化是肺泡壁明显增厚、细胞数量显著增多甚至局灶性肺实变。预先使用HMGB1抑制剂SB后肺泡壁变薄、细胞数量减少，有理由推断，肺泡壁细胞数增多很可能为表达上调的HMGB1引起炎症细胞聚集所致，这也从形态学变化角度诠释了HMGB1参与介导了创伤应激引起的大鼠急性肺损伤。

综上所述，本研究结果显示，挤压大鼠双后肢创伤应激能引起急性肺损伤，而HMGB1介导了创伤应激引起的肺组织ERS进而引起急性肺损伤，表明创伤应激启动HMGB1-ERS通路是导致急性肺损伤的分子机制。