LC-MS/MS法快速测定头发中可卡因及其代谢物苯甲酰爱康宁

潘美如 ，强火生 ，沈保华 ，严 慧 ，向 平

（1.沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110016；2.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；3.广州万孚生物技术股份有限公司，广东 广州 510663）

头发作为生物检材，与其他生物样品相比具有易获取、易保存、目标物稳定、检出时限长、能反映较长时间（几个月或几年）的药物使用情况等优点[1]。目前头发作为检材已广泛应用于体内滥用药物的分析。可卡因（cocaine）是常见的违禁滥用药物之一，属中枢神经兴奋剂，其体内主要代谢物是苯甲酰爱康宁（benzoylecgonine）[2-3]，其主要毒性表现为对神经系统的兴奋作用。可卡因滥用情况严重，2017年联合国全球报告[4]指出，可卡因缉获量呈增长趋势，2015年达到864t。目前，在我国“毒品地下黑市”也已出现可卡因，尽快对其建立快速有效的分析方法是非常必要的。可卡因及代谢物苯甲酰爱康宁的分析可采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）[5-6]、液相色谱-质谱联用（LC-MS）[7-8]等方法。近几年，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法的应用越来越受到人们的青睐，与GC-MS法相比具有更广阔的应用前景[9]。头发中可卡因和代谢物苯甲酰爱康宁的分析一直是研究热点之一[6-8]。因为可卡因易分解，可卡因及其代谢物包埋在头发角蛋白中，一方面要将目标物从头发角蛋白中有效释放出来，另一方面又要防止目标物水解，故除了区分外污染问题[10]，样品前处理也很关键。本实验旨在建立简便、快速的LC-MS/MS法同时测定头发中可卡因和苯甲酰爱康宁，并将该方法应用于实际案例，为司法鉴定中相关案例的检验提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

API 4000 Q TRAP四极杆-线性离子阱质谱仪（美国AB公司）配备AcquityTMUltra Performance LC超高效液相色谱仪（美国Waters公司），SB2200-T超声波清洗仪（美国Branson公司），Centrifuge 5810R冷冻离心机（德国Eppendorf公司），BSA124S电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］。

可卡因标准品（1 mg/mL）、苯甲酰爱康宁标准品（1mg/mL）、可卡因-D3（100μg/mL）和苯甲酰爱康宁-D8（100 μg/mL）购自美国 Cerilliant公司，甲醇（HPLC级）、乙腈（HPLC级）购自美国Sigma-Aldrich公司，乙酸胺（色谱纯）和甲酸（优级纯）购自瑞士Fluka公司，丙酮（分析纯）和二氯甲烷（分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司，去离子水由Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）制得。

1.2 样本

空白头发样本采集自10名无精神活性物质接触史的健康志愿者。

3例可卡因滥用者阳性头发来源于司法鉴定科学研究院（原司法部司法鉴定科学技术研究所）2015年受理的涉毒鉴定案例。贴根剪取滥用者头顶部头发，取根部起0～3cm段（黑色）用于分析。

该研究方案经司法鉴定科学研究院伦理委员会批准通过。采集样品前征得本人同意。

1.3 样品处理

1.3.1 去污处理

将头发样品置于具塞试管中，依次用4 mL去离子水清洗3次、4mL丙酮清洗3次，收集最后一次丙酮溶液，吹干后分析复溶液以排除外污染因素。取出已处理的头发晾干，剪成约1mm段，待检。

1.3.2 样品提取

称取头发20mg，置于5mL玻璃试管中，加入内标工作溶液（可卡因-D3和苯甲酰爱康宁-D8，2μg/mL）10 μL，再加入甲醇 0.5 mL，超声 30 min以释放目标物，然后以离心半径9.5cm，13 000r/min，离心3 min，将上清液转移至样品瓶中，供检。

1.4 仪器条件

色谱条件：液相色谱柱为Restek Allure PFP丙基柱（2.1 mm×100 mm，5 μm），前接 Phenomenex 保护柱（2.1mm×12.5mm，5μm）；流动相为 V（乙腈）∶V（20mmol/L乙酸铵、0.1%甲酸和 5%乙腈）=80∶20；恒流洗脱 8min，流速为200μL/min；柱温为室温；进样量为5μL。

质谱条件：电喷雾离子源采用正离子模式（ESI+）；离子喷射电压：5500V；碰撞气：7psi；气帘气：30psi；雾化气（GS1）：35 psi；辅助气（GS2）：35 psi；离子源温度：550℃。采用多反应监测（MRM）模式，各化合物质谱参数见表1，选用两个母离子-子离子对进行定性分析，其中一对离子对用于定量分析。

表1 可卡因及其代谢物、内标的质谱参数

1.5 方法学验证

1.5.1 选择性

取10份不同来源的空白头发样本分别按照已建立的方法进行分析，考察头发是否干扰目标物及其内标的测定。

1.5.2 基质效应

基质效应是LC-MS/MS分析时需考察的指标，表现为离子增强或抑制作用。采用PETERS等[11]建议的方法，选取0.02、0.50和9.00ng/mg 3个质量分数添加样品，每个质量分数6份，将标准品溶液进样的峰面积设为A，空白头发按照1.3.2节处理后加入相同质量分数标准品溶液进样后的峰面积设为B，基质效应=B/A×100%。

1.5.3 线性关系和检出限

取空白头发20mg，分别加入可卡因和苯甲酰爱康宁标准溶液，制得 0.02、0.05、0.20、0.50、2.00、5.00 和10.00ng/mg的头发样品，按照1.3.2节处理，以每个目标物质量分数为横坐标（x），目标物与内标的峰面积比值为纵坐标（y），用加权（W=1/X）最小二乘法进行回归运算，求得线性方程。以信噪比（S/N）≥3的质量分数为检出限（limit of detection，LOD），以 S/N≥10的质量分数为定量限（limit of quantification，LOQ）。

1.5.4 精密度和准确度

取空白头发20 mg，添加可卡因和苯甲酰爱康宁标准溶液，分别制得0.02、0.50和9.00 ng/mg 3个质量分数的添加样品，每个质量分数6份，按照1.3.2节处理后进样分析，计算得每个质量分数样品的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）作为日内精密度。连续4d，计算得每个质量分数样品的RSD作为日间精密度。经线性方程计算的校正值与实际添加质量分数的百分比为准确度。

1.5.5 稳定性

取空白头发20 mg，添加可卡因和苯甲酰爱康宁标准溶液，分别制得0.02、0.50和9.00 ng/mg 3个质量分数的添加样品，按照1.3.2节处理后立即进样，然后每隔2 h进样1次，以10次进样的峰面积的RSD评价稳定性。

2 结 果

2.1 方法学验证

2.1.1 选择性

10份不同来源的空白头发经预处理后，在待分析化合物对应的保留时间窗处均无内源性干扰峰出现，说明方法的选择性良好。

2.1.2 基质效应

采用本研究建立方法分析，头发中可卡因和苯甲酰爱康宁的基质效应均高于92.6%，无明显基质影响（表2）。

表2 方法的基质效应、精密度、准确度和稳定性 （%）

2.1.3 线性关系和检出限

头发中可卡因和苯甲酰爱康宁在0.02～10.00ng/mg质量分数范围内具有较好的线性关系。线性回归方程分别为：y=0.026x+0.0034（r=0.9941）和 y=0.018x+0.0038（r=0.9977）。头发中可卡因和苯甲酰爱康宁的LOD均为0.01ng/mg，LOQ均为0.02ng/mg。

2.1.4 精密度和准确度

本方法的日内和日间精密度均小于8%（表2），准确度在95.2%～107.9%，表明方法的准确度及精密度良好，符合生物样品测定偏倚在±15%的要求。

2.1.5 稳定性

在24h内10次进样的RSD值均小于8%（表2），表明方法的稳定性良好。

2.2 案例应用

将可卡因滥用者头发按照1.3.2节处理后分析，头发的最后一次清洗液中均未检出苯甲酰爱康宁和可卡因。3例可卡因滥用者头发中均检出苯甲酰爱康宁和可卡因，结果见表3，苯甲酰爱康宁质量分数为0.41～3.56ng/mg，可卡因质量分数为0.76～6.42ng/mg。头发中可卡因的质量分数均高于苯甲酰爱康宁。

表3 阳性头发中可卡因和苯甲酰爱康宁质量分数的测定结果

3 讨 论

本研究中头发样品的前处理采用甲醇超声法。甲醇超声法是毛发样品处理的常用方法之一，虽然与毛发完全消解的碱水解方法相比释放不够完全[7]，但不会造成可卡因的分解，另一方面，减少了毛发基质对之后LC-MS/MS法检测的干扰。

本研究毛发经甲醇超声后直接进样，快速、简便，而且可减少提取处理的误差。采用氘代内标可卡因-D3和苯甲酰爱康宁-D8，其与分析物相似的理化性质有效降低了测定的随机误差，方法的精密度和准确度均较好。

根据国际毛发分析协会（Society of Hair Testing，SOHT）的建议，进行毛发分析时，可卡因和苯甲酰爱康宁的确认分析cutoff值分别为0.50 ng/mg和0.05ng/mg，本研究采用LC-MS/MS法的MRM模式进行分析，所建立的方法LOQ均为0.02 ng/mg，可满足要求。

与THIBERT等[12]报道的LC-MS法检测可卡因和苯甲酰爱康宁的LOD（0.07 ng/mg）相比，本研究建立的LC-MS/MS快速测定法具有灵敏度高、进样量少、样品处理简便、操作简单快速的优势。本研究中可卡因和苯甲酰爱康宁的LOD均为0.01ng/mg，比POLLA等[13]研究头发中可卡因和苯甲酰爱康宁的LOD分别为0.50ng/mg和0.05ng/mg要低。本研究的灵敏度较高，可满足实际案例头发中微量可卡因和苯甲酰爱康宁的分析要求，适用于快速测定分析。

3例可卡因滥用者头发样品中可卡因含量均高于苯甲酰爱康宁，与文献[14]报道一致。药物进入毛发与药物本身的理化性质密切相关，亲脂性越强越容易进入毛发。代谢物苯甲酰爱康宁结构上含有羧酸基团，极性增强，相对可卡因难以进入毛发。

可卡因的头发分析中需要排除烟雾、被动接触等外污染的可能，按照SOHT的建议，苯甲酰爱康宁与可卡因的浓度比值应大于0.05。本研究所分析实际案例中样品苯甲酰爱康宁与可卡因的比值分别为0.55、0.54和0.32，均大于0.05，因此，可排除外污染干扰，进行阳性认定。

我国实验室在可卡因的头发分析中还需要更多的数据积累。首先，毛发中药物浓度与毛发中黑色素含量密切相关[15]，目前的高加索人浅色头发资料无法简单应用于亚洲黑色头发人群；其次，毛发中可卡因和苯甲酰爱康宁的含量及其比值与样品前处理方法密切相关，不同的前处理方法，如酸水解、碱水解和甲醇浸泡方法，可导致非常大的差别[16-17]。

本研究采用甲醇超声提取的前处理方法，简便快速。所建立的头发中可卡因和苯甲酰爱康宁的LCMS/MS测定方法，灵敏度高，LOD均为0.01 ng/mg。3例阳性头发样本中均同时检出可卡因和苯甲酰爱康宁，且可卡因含量均高于苯甲酰爱康宁。该方法可在涉毒、交警部门驾照重新申领、高危职业监督等检测中发挥快速、准确、高效的作用。