非洲猪瘟病毒p30-54融合蛋白基因的构建、表达及其多克隆抗体制备

李 杰，张星星，郭 晶，孟庆玲，乔 军*，张国武，王晓婷，李 妍，才学鹏

(1.石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子 832003； 2.新疆农垦科学院 省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室，新疆 石河子 832000； 3.中国农业科学院 兰州兽医研究所，甘肃 兰州 730046)

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起猪的一种急性、热性、高度接触性传染病[1-3]，以高热、食欲废绝、皮肤和内脏器官出血为临床特征，病死率高[4]。该病被世界动物卫生组织(OIE)定为法定报告动物疫病[5]。ASF最初主要在非洲流行，随后在意大利撒丁岛、西班牙、葡萄牙、加勒比地区、巴西以及东欧等国家或地区被发现[6]。2017 年，俄罗斯远东地区发生ASF疫情，导致该病传入我国的风险不断增加。因此，我国急需提高对该病的检疫和监测能力。

目前，血清学检测是诊断和监测猪群ASFV感染的重要方法之一[7]。然而，现有的ASFV血清学检测方法中，所使用的ASFV诊断抗原或为细胞培养的全病毒抗原，或为ASFV单一的重组蛋白。细胞培养的全病毒抗原虽然敏感性较高，但需要培养活病毒，存在生物安全方面的问题[8]；单一重组蛋白抗原虽具有较高的特异性，但敏感性不高，检出率较低。因此，制备特异性强和敏感性高的ASFV诊断用抗原是研发高效血清学诊断方法的关键。有研究表明，p30和p54蛋白均可诱导特异性免疫反应，其中p30具有最佳的诊断抗原性能[7]。鉴于此，本研究将ASFVp30和p54基因进行融合，构建了p30-54融合基因，并在大肠杆菌表达系统中进行表达，分析了融合蛋白的反应原性，制备了抗ASFV p30-54融合蛋白多克隆抗体，以期为ASFV诊断用抗原的研发奠定基础。

1 材料和方法

1.1 载体、菌株及试剂

pET-28a(+)、pMD18-T载体、E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)由石河子大学动物科技学院寄生虫实验室保存。IPTG、X-gal、DNA Marker、核酸限制性内切酶(EcoRⅠ、XhoⅠ)、T4 DNA Ligase和标准蛋白质Marker均购自TaKaRa公司。ASFV阳性血清由中国农业科学院兰州兽医研究所惠赠。辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG购自北京博奥森生物技术有限公司。商品化ASFV抗体检测ELISA试剂盒(西班牙INGENASA公司生产)购自广州测迪生物科技有限公司。

1.2 ASFV p30和p54基因的体外合成

根据GenBank中登录的ASFVp30和p54基因序列，运用在线软件Racc(http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC)对上述基因序列中大肠杆菌稀有密码子预测分析，将其稀有密码子优化为大肠杆菌偏爱密码子，由华大基因有限公司进行体外合成。

1.3 ASFV pT-p30-54重组质粒的构建

通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)进行p30-54融合基因的构建。根据p30和p54基因序列，设计PCR引物。Fp30：5′-GGAATTCATGGATTTTATTTTAAATATATCC-3′(下划线部分为EcoRⅠ酶切位点);Rp30：5′-GTTTAATGACCATGAGTCTTA-3′。Fp54：5′-GAGCACATAACTTTATTCAAACCA-3′；Rp54：5′-CCTCGAGTTACAAGGAGTTTTCCAGGTC-3′(下划线部分为XhoⅠ酶切位点)。用Fp30-Rp30扩增p30基因片段、Fp54-Rp54扩增p54基因片段，分别回收PCR产物。SOE-PCR采用20 μL反应体系：Fp30、Rp54引物各0.5 μL，10×Pfu Buffer 2 μL，PCR产物各2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，Pfu DNA聚合酶0.2 μL，加水至20 μL。SOE-PCR反应条件：95 ℃ 4 min；95 ℃ 50 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，20个循环；72 ℃ 10 min。SOE-PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳并回收后，克隆入pMD18-T载体中，构建重组质粒pT-p30-54，进行测序。

1.4 重组表达载体pET-p30-54的构建与鉴定

用EcoRⅠ和XhoⅠ分别对pT-p30-54和pET28a(+)质粒双酶切，用DNA凝胶回收试剂盒回收p30-54目的基因和载体片段，用T4 DNA 连接酶4 ℃过夜连接，然后转化入E.coliDH5α感受态细胞中，在含氨苄青霉素抗性的固体培养基中37 ℃过夜培养，挑取单菌落，再经PCR和双酶切鉴定的方法筛选获得阳性克隆pET-p30-54。

1.5 ASFV p30-54融合蛋白的诱导表达

将鉴定正确的重组载体pET-p30-54转化至E.coliBL21 (DE3)感受态细胞中，次日挑取单个菌落接种于LB液体培养基37 ℃过夜培养，次日取200 μL菌液接种于20 mL含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，加入1.0 mmol/L IPTG诱导6 h，收集菌液。

1.6 ASFV p30-54融合蛋白的SDS-PAGE检测和 Western blot 分析

将收集的菌液12 000 r/min离心1 min，收集菌体，进行SDS-PAGE电泳分析。以ASFV阳性血清为一抗、辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG为二抗，对重组融合蛋白进行Western blot 分析。

1.7 多克隆抗体制备、纯化和特异性检测

将 IPTG诱导后的菌液用超声破碎，按照Ni亲和层析柱的操作步骤进行p30-54融合蛋白的纯化。将12只健康的昆明系小鼠分成试验组和对照组，每组6只；将纯化后的p30-54融合蛋白溶液终质量浓度调整为1 mg/mL，与弗氏完全佐剂按体积比1∶1混合，制备免疫原；同时将0.01 mol/L、pH值为7.2的PBS缓冲液与弗氏完全佐剂按体积比1∶1混合作为对照；然后通过皮下多点注射分别注射试验组和对照组小鼠，进行首次免疫，免疫剂量为200 μL；在首免10 d后进行第2次免疫，二免2周后采血，分离血清，利用商品化的ASFV ELISA抗体检测试剂盒进行抗体检测。

2 结果与分析

2.1 重组质粒pT-p30-54的构建与鉴定

pT-p30-54经PCR扩增可得到与预期大小相符的1 140 bp目的基因片段(图1)。经双酶切(EcoRⅠ和XhoⅠ)可得到1 140 bp的目的基因片段和2 692 bp的载体片段(图2)。测序结果显示，构建的重组质粒含有ASFV完整的p30-54基因序列(图3)，表明成功构建了重组质粒pT-p30-54。

M.DNA Marker ；1—2.重组质粒pT-p30-54；3.阴性对照

M.DNA Marker；1.pT-p30-54双酶切；2.pT-p30-54单酶切

第1行为p30-54融合基因核苷酸序列：1—582位核苷酸为p30基因序列,583—1 140位核苷酸为p54基因序列；第2行为p30-54融合基因编码的氨基酸序列

2.2 重组表达载体pET-p30-54的构建与鉴定

重组质粒利用特异性引物成功扩增出大小为1 140 bp的p30-54融合基因片段(图4)。用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后得到1 140 bp的目的片段和5 369 bp的pET-28a(+)载体片段(图5)。表明成功构建了重组表达载体pET-p30-54。

2.3 ASFV p30-54融合蛋白的SDS-PAGE检测及Western blot分析结果

SDS-PAGE检测结果表明，ASFV融合蛋白p30-54在47.1 ku处有明显条带，与理论完全相符(图6)。Western blot分析发现，表达的p30-54融合蛋白可与ASFV阳性血清发生免疫学反应，提示融合蛋白p30-54具有反应原性。

M.DNA Marker；1—3.pET-p30-54阳性克隆PCR扩增结果；4.阴性对照

M.DNA Marker；1.pET-p30-54；2.pET-p30-54双酶切；3.pET-p30-54 单酶切

M.蛋白质分子质量标准；1—3.pET-28a(+)空载体转化菌株的诱导；6—8.pET-p30-54转化菌株诱导的表达产物；9.Western blot分析

2.4 ASFV p30-54融合蛋白多克隆抗体的制备及特异性检测结果

利用ASFV ELISA抗体检测试剂盒对免疫小鼠的血清进行检测，结果显示，ASFV p30-54融合蛋白免疫的小鼠血清均呈阳性，而对照组小鼠血清均呈阴性，表明成功制备了小鼠抗ASFV p30-54融合蛋白抗体。

3 结论与讨论

ASFV是目前已知的唯一DNA虫媒病毒，基因组为线性双链DNA，长度在170～190 kb[4-5]，编码150～200个病毒蛋白，其中p30、p54、p72等结构蛋白是该病毒与宿主细胞相互作用的主要蛋白[6,9-10]，不但在病毒黏附和侵入过程中发挥着重要的作用[9]，而且可诱导机体产生免疫应答[11]。Lacasta等[12]构建了ASFV基因组表达文库，结果发现，含有ASFVp54、p30、p72和可溶性血凝蛋白(sHA)编码基因的文库可诱导机体产生较强的细胞免疫和体液免疫，表明p30、p54、p72等结构蛋白具有较强的免疫原性和反应原性。

目前，酶联免疫吸附试验(ELISA)是ASFV血清学检测最常用的方法[13-15]，国外已经研发出商品化的试剂盒。西班牙研制的ASFV ELISA抗体检测试剂盒通过阻断酶标记免疫吸附测定法，将ASFV抗原预包被于聚苯乙烯微孔板上，加入待检样品后，样品中抗体将与其抗原结合，洗涤后加入酶标记抗体和底物显色，从而检测样品中ASFV抗体水平。然而，进口的ELISA检测试剂盒价格昂贵，限制了其广泛使用，而国内ASFV检测试剂盒尚处于研发中。董志珍等[16]以原核表达的ASFV p30重组蛋白包被反应板，样本或标准品中的ASFV抗体能与酶标板中包被的p30抗原反应，同时加入针对p30的酶标单克隆抗体后参与抗原表位的竞争，建立了一种检测ASFV抗体的竞争ELISA试剂盒。Sastre等[17]建立了基于ASFV p72单抗的免疫层析法(LFA)，用于ASFV抗原的检测。结果表明，建立的LFA方法与商品化的ELISA之间存在很好的相关性，虽然其敏感性略低于PCR方法(PCR检测阳性率为38%，LFA为27%)，但明显高于ELISA检测试剂盒。该方法适用于野外测试野生动物，并可用于设备简陋的实验室。Kazakova等[8]利用原核表达系统表达了p30蛋白，通过免疫印迹试验评估了p30 重组蛋白对ASFV抗体的检测能力，对试验性和自然感染ASFV的家猪和野猪血清样品进行了检测，其特异性和敏感性可达98.75%和100%，并且感染6～8周后血清样品即可检测出特异性的ASFV抗体。

近年来，中国养猪业正面临着ASF传入的严峻威胁，尤其是新疆北部，新疆边境线长达5 600 km，虽然与俄罗斯接壤地区目前尚未发生ASF疫情，但随着ASF疫情的不断扩散，新疆具有极大的传入风险，可能成为该病传入我国的一个重要窗口。为此，我国农业农村部发布了《非洲猪瘟疫情应急预案》，严防该病从境外传入我国。因此，研发ASFV特异、敏感的检测试剂对于防范ASF传入我国具有十分重要的现实意义。本研究表达了ASFV p30-54融合蛋白，并成功制备了抗该融合蛋白的多克隆抗体，为研发ASFV诊断试剂奠定了基础。