C595对人肺癌A549细胞株增殖及凋亡作用

张录民 姚健 陈玲玲

近年来，肺癌发生率呈逐年增加趋势，并呈逐渐年轻化趋势，严重影响着人类的健康和生活质量[1]。化疗是目前临床治疗中晚期肺癌的主要手段，尤其是随着化疗药物增加，各种药物不断面市，抗癌作用明显增强，越来越多的研究加以肯定，但仍未能解决化疗药物的抗癌问题[2-3]。有资料[4]报道，肿瘤相关抗原MUCI是一种高度糖基化的1型膜转运糖蛋白，在肿瘤侵袭与转移过程中均有参与。本文就探讨MUC1蛋白核心的重复序列IgG3单克隆抗体（C595）对人肺癌A549的影响。

1 资料与方法

1.1 材料

于2018年1—5月行此次检测试验，于中国科学院细胞库提供的人肺癌A549细胞株，日本同仁化学研究所提供的细胞计数试剂盒8。单克隆抗体C595由英国诺丁汉大学提供，非特异性同型对照单克隆抗体IgG1由澳大利亚新南威尔士大学提供。武汉博士德生物工程公司提供的ABC免疫组化试剂盒；美国Mefck chemicals公司提供的细胞凋亡原位检测（TUNEL），美国RD Systems公司提供的酶联免疫吸附剂（ELISA）。

1.2 细胞培养

取10％胎牛血清的AMEM完全培养基进行人肺癌A549细胞培养，于恒温培养箱内，维持37℃环境、5％CO2及饱和湿度环境内进行细胞株培养与传代，每2～3 d对其进行一次换液传代，以对数生长周期细胞进行实验。

1.3 MUC1表达检测

取对数生长期A549细胞及细胞/孔接种于24孔板内生长培养24 h，细胞完全贴壁，取出盖玻片，以TBS轻洗，冰甲醇溶液室温固定10 min，TBS漂洗后，在室温下滴加C595单克隆抗体保持1 h，再取二抗Alexa羊抗鼠488抗体室温下孵育1 h，TBS漂洗，用P1溶液染色1 h，镜下检测观察。采取间免疫荧光法检测，0.25％胰蛋白酶消化A549细胞株，制成单细胞悬液，用含有5％胎牛血清PBS洗涤，离心5 min，1 000 r/min，丢弃上清液，滴加32 μg/ml C595孵育。PBS洗涤，加入5％胎牛血清。流式细胞仪检测前加入碘化丙啶。

1.4 细胞增殖

收集对数生长期A549细胞，放置200 μl/孔接种于96孔板内，在37℃、5％CO2及饱和湿度培养箱内培养24 h，取出培养板，随机分为两组：对照组：加入等体积培养液；观察组：培养板内加入最终度5、25、50、75、100 μg/ml单抗C595，每组设3个复孔，无细胞的培养液为凋零组。加入MTT20 μl继续培养，离心丢弃上清液，加入100 μl DMSO，充分振荡混匀，在酶标仪上加入562 nm波长检测吸光值，计算细胞增殖抑制率。

1.5 细胞凋亡检测

采取TUNEL法检测，取12孔板、2×105个细胞或细胞孔进行细胞培养24h，随机分为两组：对照组：加入等体积培养液；观察组：加入IC50单抗C595；培养48 h，收集漂浮细胞以及贴壁细胞，在经PBS洗涤后，制备成细胞悬液，制作成细胞甩片，在2％多聚甲醛室温保持20min，按照说明书操作。阳性对照：阳性对照切片，阴性对照：TBS代替TDT反应液。

1.6 统计学方法

用SPSS20.0统计学软件包处理数据，计数资料用％表示。

2 结果

2.1 单抗C595标记的MUC1在A549细胞上的标准

显微镜下观察单抗C595标记的MUC1在A549细胞上表达，具体见表1。

表1 两组单抗C595标记的MUC1及其表达量

2.2 C595对A549细胞株增殖的影响

C595浓度增加，A549细胞株增殖抑制效果越强，凋亡率增加，存活率降低，经48 h细胞生长抑制率计算：C595作用A549细胞为 38 μg/ml。

2.3 C595对A549细胞株凋亡的影响

通过TUNEL检测法检测，对A549细胞株采取40 μg/L单抗C595治疗48 h，A549细胞核染色呈显著棕黄色，多见阳性染色细胞数；对照组见细胞核染色不明显，几乎不存在染色细胞数；C595对人肺癌A549细胞株凋亡作用明显。

3 讨论

肺癌是目前危害人类身心健康的首位恶性肿瘤，多数患者在确诊后病情进展至中晚期，进而错失了手术最佳时机[5-6]。目前化疗药物的开发与应用，明显改善了患者病情，但由于化疗药物耐药性，使患者5年生存率降低。因此，选择更为安全有效的化疗药物，提高患者5年生存率是临床亟待解决的问题。MUCI是一种高度糖基化的1型膜转运糖蛋白，通常分布在正常腺上皮细胞的顶端位置，在90％腺癌中过度表达[7]。C595属于MUC1的IgG3单克隆抗体，是患者MUC1的蛋白核心[8]。有相关研究资料[9]报道，在90％以上的晚期肺癌者中C595呈阳性表达，在正常人体组织中并无C595表达。本次调查发现，A549细胞膜表面覆盖有97.3％MUC1表达量，阴性对照组MUC1表达量为1.03％。因此单抗C549于A549细胞膜表面生长。在对肺癌A549细胞株作用发现，随着作用时间延长，不同浓度单抗C595对A549细胞增殖的抑制作用也不同。线粒体途径是致细胞凋亡的主要机制，细胞色素C于线粒体释放到胞浆，在使用C595治疗A549细胞株48h后，A549细胞数明显凋亡[10]。单抗C595诱导癌细胞凋亡，主要是依靠是单抗C595能够产生补体依赖的细胞毒性作用，以及抗体依赖的细胞介导的毒性作用，进而促使肺癌细胞A549凋亡，并抑制其生长[11-12]。总而言之，单克隆抗体C595在体外抑制人肺癌细胞A549生长，若C595浓度增加，A549细胞存活率降低，凋亡率增加，而C595诱导A549凋亡的发病机制需进一步明确。