PC12细胞转染人ApoE3基因后的抗氧化损伤作用

赵瑞 姚黎清

[摘要] 目的 观察人类ApoE3基因过表达对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12凋亡的影响。 方法 将PC12转染含人ApoE3基因的pEGFP质粒及空载体pEGFP质粒，经持续筛选建立起稳定表达人ApoE3基因和质粒pEGFP的PC12的细胞系。将细胞分成4组：正常对照组（用正常培养基培养）、H2O2组（用400 μmol/L H2O2诱导4 h）、H2O2+空质粒组（细胞转染pEGFP经筛选后用H2O2诱导4 h）、H2O2+ApoE3组（细胞转染ApoE3经筛选后用H2O2诱导4 h）。通过CCK-8检测细胞存活率，Hochest33258检测细胞凋亡。 结果 与正常对照组比较，H2O2组、H2O2+空质粒组和H2O2+ApoE3组细胞存活率下降（P < 0.05），细胞凋亡增加。H2O2组和H2O2+空质粒组各指标比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；H2O2+ApoE3组细胞存活率明显高于H2O2组、H2O2+空质粒组（P < 0.05），H2O2组+ApoE3组细胞凋亡较H2O2组和H2O2+空质粒组明显减少。 结论 ApoE3基因高表达对H2O2所致的PC12细胞氧化损伤有很好的保护作用。

[关键词] PC12细胞；载脂蛋白E3基因；过氧化氢；凋亡

[中图分类号] R744 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）06（b）-0004-04

[Abstract] Objective To observe the effect of human ApoE3 gene high expression on the apoptosis of rat adrenal pheochromocytoma PC12 cells. Methods The pEGFP plasmid containing human ApoE3 gene and pEGFP plasmid were transfected with PC12 cells， and PC12 cell line was established that could stably express human ApoE3 gene and pEGFP plasmid through continuous screening. PC12 cells were allocated into 4 groups： normal control group， H2O2 group （cultured with 400 μmol/L H2O2 for 4 hours）， liposome group （pEGFP transfection and H2O2 culture） and ApoE3 group （ApoE3 transfection and H2O2 culture）. Cell survival was tested by CCK-8 method， cell apoptosis was detected by Hochest33258. Results Compared with the normal control group， cell survival rate was decreased in the other three groups （P < 0.05）， while cell apoptotic was increased. The differences in the indexes mentioned above were not significant between H2O2 group and liposome group（P > 0.05）. The cell survival rate was higher in the ApoE3 group， compared with H2O2 group and H2O2+liposome group （P < 0.05）； the apoptosis was obviously lower in the ApoE3 group， compared with the H2O2 group and H2O2+liposome group. Conclusion The overexpression of ApoE3 gene has a great protective effect on the oxidative damage of PC12 cell mediated by H2O2.

[Key words] PC12 cells； Apolipoprotein E3 gene； Hydrogen Peroxide； Apoptosis

脊髓损伤是一类致残率和致死率均较高的中枢神经系統疾病，由于此类疾病治疗困难，术后康复时间长，多预后不良，给患者家庭以及社会造成沉重的经济负担。急性期脊髓二次损伤的发生与活性氧（reactive oxygen species，ROS）的大量聚集密切相关，氧化应激成为脊髓损伤的一个特点，大量ROS通过氧化细胞的DNA、蛋白质和细胞膜损害细胞。载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）作为中枢神经系统中最主要的载脂蛋白，参与了神经元脂质的代谢、钙的转运、信号的转导等，与脑外伤、脑出血性疾病和脊髓损伤患者的预后都有密切的关系。人类ApoE存在ApoE2、ApoE3、ApoE4三种亚型，在疾病的发生和预后等方面，不同亚型的携带者表现出不同的效应，其中ApoE2、ApoE3能促进脊髓损伤患者功能恢复，ApoE4对脊髓损伤患者功能恢复有不良影响[1]。近年来越来越多的研究发现ApoE参与了脊髓损伤后氧化应激的过程[2]。本实验拟用H2O2刺激PC12细胞建立氧化损伤模型，用以研究脊髓损伤后神经细胞病理学变。

1 材料与方法

1.1 实验材料及来源

PC12细胞购自中科院昆明动物所；脂质体2000（Lipofectamine 2000）购自Invitrogen公司产品；遗传霉素（G418）为Sigma产品；过氧化氢（H2O2）为天津市风船化学试剂科技有限公司产品；高糖培养基（DMEM）为Hyclone公司产品；胰蛋白酶购自GIBICO公司；胎牛血清为BI公司产品；DMSO购于上海生物工程有限公司；CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒试剂为日本同仁公司产品；Hochest33258试剂为凯基公司产品；携带人ApoE3基因的质粒（pEGFP-N1-H-ApoE3）上海吉满公司构建。

1.2 方法

1.2.1 PC12细胞培养

PC12细胞按常规细胞培养方式培养，将细胞接种于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素的DMEM培养基中，培养基置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中。消化传代使用含有EDTA的0.25%胰酶，选取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 基因转染及细胞筛选

1.2.2.1 细胞转染 取对数生长期的PC12细胞经胰酶消化后，以1×105/mL密度接种于6孔板中，待细胞生长至80%融合时，取2 μg质粒加入到200 μL基础培养基中轻轻摇匀后在室温下放置5 min；取10 μL脂质体加入到200 μL基础培养基中轻轻摇匀后再在室温下放置5 min；然后混合稀释的脂质体和质粒轻轻摇匀，室温孵育30 min，最后将混合液轻轻加入到待转染的细胞中，4～6 h后换液。

1.2.2.2 细胞筛选 ①最佳G418筛选浓度确定：设置不同的G418梯度浓度连续培养细胞2周，以细胞完全死亡的最低G418浓度为筛选浓度，根据预实验确定最佳G418筛选浓度为1000 μg/mL；②将转染后24 h的细胞用1000 μg/mL G418连续筛选培养2周，每2天换液1次，直到单性克隆细胞株出现；挑选单克隆细胞株扩增培养。

1.2.3 实验分组

①正常对照组（正常细胞培养）；②H2O2组；③H2O2+空质粒组（转染pEGFP-N1+H2O2）；④H2O2+ApoE3组（转染pEGFP-N1-H-ApoE3+H2O2）。

1.2.4 H2O2诱导PC12细胞损伤模型的建立

取对数生长期的细胞，细胞计数密度为4×104个/mL铺于96孔板中，每孔100 μL。培养24 h后，分别采用0、200、400、600、800 μmol/L的 H2O2进行干预，每孔设5个复孔，损伤4 h后用CCK-8检测细胞活性以确定最佳损伤浓度。

1.2.5 ApoE3对PC12细胞的保护作用检测

正常对照组加入100 μL基础培养基；模型组400 μmol/L H2O2作用4 h；空质粒组400 μmol/L H2O2作用4 h；ApoE3组400 μmol/L H2O2作用4 h，4 h后加入CCK-8避光孵育1～4 h后酶标仪检测OD值；按照公式计算细胞存活率：细胞存活率（%）=（实验组-空白对照组）/（正常对照组-空白对照组）×100%。

1.2.6 细胞凋亡检测

细胞转染率计算（Hochest33258 染色法）：正常Hochest33258荧光染色显示PC12细胞核圆呈淡蓝色荧光，凋亡细胞的胞核呈强亮白色荧光。实验时先使用PBS清洗3遍，用4%的多聚甲醛室温固定细胞30 min，PBS清洗3遍然后每孔加入300 μL Hoechst33258染色液，室温下避光染色5 min，PBS清洗3次，在正置荧光显微镜下观察并照相。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；相关性分析采用Pearson相关，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ApoE3蛋白在PC12细胞中的表达

光学显微镜观察所示，ApoE3组细胞形态没有发生改变，细胞呈锥形，遮光性好；荧光显微镜下观察可见ApoE3组细胞内表达带有绿色荧光的ApoE3蛋白。光学显微镜下所示，空质粒组细胞生长状态良好，细胞形态正常；荧光显微镜下观察可见细胞质中表达出均匀的绿色荧光蛋白。见图1（封四）。

2.2 H2O2诱导PC12最佳损伤浓度确定

与0 μmol/L H2O2组比较，200、400、600、800 μmol/L H2O2组细胞存活率降低，且与H2O2浓度呈线性负相关（r = -0.981，P < 0.05），其中400 μmol/L H2O2组细胞存活率为（48.66±0.07）%，在后续试验中采用此浓度建立PC12细胞损伤模型。见表1。

2.3 ApoE3对神经细胞的保护作用

与正常对照组比较，H2O2组、H2O2+空质粒组、H2O2+ApoE3组细胞存活率降低（P < 0.05）。H2O2+空质粒组与H2O2组细胞存活率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。与H2O2组、H2O2+空质粒组比较，H2O2+ApoE3组细胞存活率显著升高（P < 0.05）。见表2。

2.4 细胞凋亡检测结果

Hochest33258荧光染色显示：正常PC12细胞核圆呈淡蓝色，细胞核完整，凋亡细胞的胞核呈强亮白色荧光，细胞核固缩，甚至破碎；其中正常对照组细胞凋亡很少，其他组细胞凋亡明显，但H2O2+ApoE3组凋亡细胞较H2O2组和H2O2+空质粒组明显减少。见图2（封四）。

3 讨论

脊髓损伤的机制主要包括原发性和继发性两种。其中，原发性损伤是局限的、不可逆的，损伤后数分钟到数天内可逐渐形成可干预的继发损害。继发性脊髓损伤的病理改变是由微循环障碍、兴奋性氨基酸毒性、自由基损伤、一氧化氮机制、细胞调亡与坏死、钙超载、炎性反应、神经肽、内皮素、前列腺素等共同作用的结果。脊髓组织含有丰富的脂类物质，易感于脂质过氧化反应，生理状态下，内源性氧化系统（包括超氧化物歧化酶和过氧化氨酶等）为了维持人体内各种细胞和亚细胞的结构完整性，会有效地消除人体内多余的自由基。脊髓损伤后，自由基生成增加、清除障碍，脊髓组织脂质过氧化產物蓄积，细胞膜的结构、流动性和通透性遭到破坏，同时抗氧化剂水平降低、Na+-K+-ATP酶系统受抑制，脊髓组织缺血、缺氧，细胞能量代谢失常，细胞内钙超载使细胞线粒体电子传递链脱偶联，进而又产生和释放大量氧自由基，最终导致神经细胞及髓鞘的结构与功能受到损害[3-4]。有研究认为ROS可诱导脂质过氧化作用，并在脊髓损伤过程中发挥中枢性作用。ROS生成增多或未及时清理，会引起细胞凋亡、坏死或自噬，进而导致神经元功能丧失[5-6]。ApoE分子量为34 kD，由299个氨基酸组成，基因位于19号染色体上[7]，在血浆胆固醇和甘油三酯代谢中发挥重要的作用。研究人员通过离子层析和双向电泳已成功鉴定出这3种不同的亚型，主要区别在于112位的半胱氨酸和158位的精氨酸有所差异，其中人体内ApoE3的基因频率最高[8]。近年来有许多研究发现ApoE在脊髓损伤后表达量增高[9]，国外有学者利用外源性ApoE模拟肽治疗小鼠脊髓损伤效果明显[10]，这些研究印证了ApoE具有神经保护作用。ApoE4基因作为阿尔茨海默病的危险因素早已被人们所熟知[11-13]。有研究发现ApoE2、ApoE3能够促进神经元突起生长，使神经元突起数量增加更快，而ApoE4的作用明显弱于ApoE2和ApoE3[14]。这种作用是因为ApoE与线粒体膜上F1-ATPase亚基结合破坏了线粒体结构[15]，而神经元的线粒体主要参与了突触的发生功能。

氧化应激在继发性脊髓损伤中发挥主导作用，越来越多的研究表明ApoE与氧化应激有关。有文献报道ApoE4可以和神经元中的线粒体结合，这就为人们研究ApoE与氧化应激的相关性提供了一个重要的靶点，它提示ApoE可能通过作用于线粒体来影响氧化应激[15]。研究表明内源性ApoE会降低中枢神经系统炎性反应及氧化应激反应程度从而发挥神经保护作用[16]。氧化应激不仅会造成细胞的损伤而且可以通过激活细胞内的信号通路引起细胞凋亡，也有学者发现ApoE可以降低细胞色素C的释放，抑制Caspase-3凋亡途径，从而发挥保护中枢神经的作用[17]，但是对于ApoE亚型的作用研究不够明确。因为相较ApoE2和ApoE4而言，ApoE3是人体内存在最多的载脂蛋白，它的作用机制对于研究ApoE对神经细胞保护作用有重要意义。

本实验通过构建人类ApoE3过表达载体，并在H2O2作用下观察其对神经细胞的保护作用。初步发现ApoE3能够提高神经细胞存活率，减少细胞凋亡。遗憾的是，关于ApoE3对神经细胞保护作用的机理目前还缺乏系统的研究，ApoE3是通过影响线粒体、ERK通路还是其他作用机制发挥神经保护作用有待进一步的研究。

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