基于生物信息学分析SLC19A3基因在乳腺癌中的表达意义及蟾毒灵的干预研究

李丹 余涛 李景 张帆 曾俊芬 彭燕

[摘要] 目的 分析可溶性载体SLC19A3基因在乳腺癌中的表达及临床意义，并探讨蟾毒灵（Bufalin）对乳腺癌细胞中SLC19A3基因的干预作用。 方法 检索Oncomine和GEO数据库中从建库至今有关乳腺癌和Bufalin干预乳腺癌的数据集，对所获取的数据资料进行数据挖掘，分析SLC19A3基因在乳腺癌组织和正常乳腺组织中的表达情况，及其与预后的关系。同时分析Bufalin对乳腺癌细胞中SLC19A3基因表达水平的影响，并结合文献资料综合分析。 结果 对Oncomine数据库中共收集的9项关于乳腺癌和乳腺正常组织SLC19A3基因有差异表达的研究数据集进行分析，发现乳腺癌组织中SLC19A3基因的表达明显高于乳腺正常组织，差异有统计学意义（P < 0.05）。通过生存分析发现低表达SLC19A3基因的乳腺癌患者无病生存期明显短于高表达者，高表达患者的预后更好（P < 0.05）。通过挖掘GEO数据库中的数据集GSE85871发现Bufalin能够上调乳腺癌细胞SLC19A3基因的表达（P < 0.01）。 结论 SLC19A3基因在乳腺癌组织中呈现低表达，并与乳腺癌患者的预后相关，该基因可能是Bufalin干预乳腺癌细胞的一个新靶点。

[关键词] 蟾毒灵；乳腺癌；SLC19A3基因；数据挖掘

[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）06（b）-0012-05

[Abstract] Objective To analyze the expression and its clinical significance of SLC19A3 gene in breast cancer and to explore the effects of Bufalin on the expression of SLC19A3 in breast cancer cells. Methods The datasets about breast cancer and effects of Bufalin on breast cancer cell were retrieved from Oncomine and GEO database， and the datasets were deeply mined and analyzed with literature. SLC19A3 mRNA expression between normal group and breast cancer group as well as correlation with prognosis were analyzed. Meanwhile， the effect of Bufalin on the expression level of SLC19A3 gene in breast cancer cells was also analyzed. Results The expression of SLC19A3 gene in breast cancer tissues was significantly higher than that of breast normal tissues through mining and analyzing the 9 datasets about SLC19A3 gene in breast carcinoma from Oncomine database （P < 0.05）. Survival analysis showed that the disease-free survival of breast cancer patients with higher expression of SLC19A3 gene was significantly better than the patients with lower expression of SLC19A3， and the prognosis of patients with high expression of SLC19A3 gene was better （P < 0.05）. Finally， the mRNA expression of SLC19A3 gene was up-regulated by Bufalin in the datasets of GSE85871 through mining the GEO database （P < 0.01）. Conclusion SLC19A3 gene is under-expressed in breast cancer and its expression level is related to the prognosis of breast cancer， which may be a new target of effects of Bufalin on breast cancer cells.

[Key words] Bufalin； Breast cancer； SLC19A3 gene； Data mining

硫胺素（又称维生素B1）是维持机体细胞能量和代谢所必需的维生素之一。由于其亲水性，硫胺素需要载体介导运输进入细胞，以维持细胞内的硫胺素供应。可溶性载体19家族有两个转运体THTR1（thiamine transporter 1）和THTR2（thiamine transporter 2）负责硫胺素的跨膜转运，他们分别由SLC19A2和SLC19A3基因来编码[1-2]。THTR1和THTR2在机体内广泛表达，THTR1高表达于骨骼肌，负责递送其底物如硫胺素到骨骼肌细胞，而THTR2高表达于肠道，介导肠道硫胺素的吸收[3-5]。在低氧应激的状况下，HIF-1α可直接结合并激活SLC19A3的表达，从而来调节硫氨素的转运来调节细胞的稳态[6]。另外，研究表明SLC19A3在急性、慢性缺氧条件下表达升高[7]。Liu等[8]在MDA231乳腺癌移植瘤鼠体内发现SLC19A3表达下调。Ng等[9]研究发现80%（12/15）乳腺癌患者SLC19A3的表達显著下调（P < 0.05）。但是这些研究样本例数较少，也比较零散。这些研究提示SLC19A3基因在乳腺癌中可能是一个抑癌基因，改变其被下调的状态将有助于预后。本研究收集GEO和Oncomine数据库中的公共数据集，并对其进行挖掘分析，以了解SLC19A3基因在乳腺癌中的表达和临床意义。由于中医中药在临床乳腺癌综合治疗中所起的作用越来越受到重视，在中医中药中寻求治疗乳腺癌的方法和药物不失于一条值得探寻的途径。在分析过程中，同时发现蟾毒灵对乳腺癌细胞SLC19A3基因表达存在影响，在此一并探讨，以期为从中医药中寻找治疗乳腺癌的靶点和药物提供思路。

1 资料与方法

1.1 数据提取

1.1.1 从Oncomine数据库中提取数据 登陆Oncomine数据库主页面https：//www.oncomine.org/，首先进行注册以获得本数据库的使用权限，然后根据如下筛选条件在数据库中进行设定，用来筛选和提取所需要的目标数据。本研究在数据库检索界面输入筛选条件：①cancer type：breast cancer；②gene：SLC19A3；③data type：mRNA或DNA；④analysis type：cancer vs. normal analysis。

1.1.2 从GEO数据库中提取数据 在PubMed主界面https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/搜索栏中找到GEO datasets，根据如下筛选条件在对应检索栏输入“Bufalin”，“Organism”设置为“Homo sapiens”来查找符合条件的数据集并下载。

1.2 观察指标

比较SLC19A3基因在乳腺癌组织和正常乳腺组织中的表达情况，及其与预后的关系。分析Bufalin干预乳腺癌细胞后对SLC19A3基因表达水平的影响。

1.3 统计学方法

所有统计学分析处理采用SPSS 20.0软件进行，作图采用Graphpad Prism 5.0软件进行，计量资料比较采用t检验。采用GEO数据库网站自带的GEO2R分析基因表达谱中的具有差异表达的基因。采用Kaplan-Meier方法计算SLC19A3表达与乳腺癌预后的关系。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SLC19A3在乳腺癌中的总体表达情况

利用Oncomine数据库筛选有关乳腺癌基因差异表达的研究，设置相应的筛选条件后可见，自2001年起共有9项研究涉及SLC19A3在乳腺癌和正常组织中的表达，共包括2484例标本。文章分别发表于Nature[10]、TCGA、Proc Natl Acad Sci USA[11]、Breast Cancer Res Treat[12]等国际权威杂志。Oncomine数据库中对这9项研究结果数据集进行二次分析发现，与对照组相比，SLC19A3在乳腺癌中呈现低表达，且差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1（封四）。

2.2 不同数据集中SLC19A3基因在乳腺癌和正常乳腺组织中的表达差异

Oncomine数据库中SLC19A3在不同乳腺癌研究数据集中的表达结果见图2。研究显示在Curtis等[10]、TCGA、Radvanyi等[11]、Glück等[12]这9项研究数据集中，SLC19A3在乳腺癌中的表达量均显著低于正常乳腺组织（P < 0.05）。表1为该9项不同研究中对应的SLC19A3低表达倍数和对应的P值。

2.3 SLC19A3基因与乳腺癌患者预后的相关性

利用上述数据库挖掘的生存信息，采用Kaplan-Meier法分析发现，SLC19A3基因的表达水平与乳腺癌患者生存预后之间存在相关性，低表达SLC19A3基因的乳腺癌患者无病生存期明显差于高表达患者，高表达患者的预后更好（P < 0.05）。见图3。

2.4 蟾毒灵对乳腺癌细胞SLC19A3基因表达的影响

通过分析GEO数据库中的数据集GSE85871，其中有关Bufalin作用于乳腺癌MCF7细胞的基因表达谱，从中提取探针号为220736_at的SLC19A3基因表达数据，t检验分析干预组和对照组之间的基因表达差异，发现Bufalin能够上调乳腺癌MCF7细胞SLC19A3基因的表达（P < 0.01）。见图4。

3 讨论

目前对SLC19A3基因的研究相对较少，但总结已有的研究结果不难发现该基因在肿瘤治疗和诊断领域的潜在价值。首先在治疗领域，SLC19A3基因作为抑癌基因，能够影响肿瘤细胞的增殖和侵袭能力。Cheuk等[13]研究发现促癌因子前列腺素受体2（EP2）能够下调SLC19A3表达，当用siRNA下调EP2表达或者用EP2受体拮抗剂（AH6809）后，乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力显著降低，而且伴随基质金属蛋白酶（MMP-2和MMP-9）的表达降低。如果过表达SLC19A3基因则细胞增殖、侵袭能力和基质金属蛋白酶的表达均降低。可见，SLC19A3基因的表达可以抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移。其次在诊断领域，SLC19A3启动子甲基化检测有望发展为肿瘤早期诊断的生物标志物。Ikehata等[14]在所研究的四种结肠癌细胞中，当使用DNA甲基化試剂和/或组蛋白去乙酰化试剂后，SLC19A3基因的mRNA水平显著下调。Ng等[9]发现与非肿瘤组织相比，乳腺癌组织中SLC19A3基因表达被显著下调，而SLC19A3基因启动子的甲基化率却显著升高（P < 0.05）。另外，Liu等[15]发现胃癌中SLC19A3启动子甲基化介导了其在胃癌中的表达被下调，故推测SLC19A3启动子甲基化可作为早期胃癌发生发展的生物标志物。

本研究为进一步探索SLC19A3基因在乳腺癌中的表达和作用，利用数据挖掘的方法分析SLC19A3基因在乳腺癌中的表达情况，以避免因研究方法、样本量和人群的差异导致的结论偏颇。本研究通过深度挖掘Oncomine数据库中收录的乳腺癌基因表达谱数据，纳入9项研究数据集共包括2539例标本，结果发现SLC19A3基因在乳腺癌组织中的表达明显低于癌旁组织。再通过Kaplan-Meier方法分析生存数据发现，SLC19A3基因低表达的乳腺癌患者无病生存期明显短于高表达者，即高表达患者的预后更好。结合诸多学者已有的研究结果可推知SLC19A3在乳腺癌的发展中起抑癌基因的作用，有望成为乳腺癌治疗的新靶点和预后的新标志。

目前中醫药在乳腺癌综合治疗中发挥着不可替代的作用。蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑框蟾蜍的耳后腺及皮肤腺分泌的白色浆液，经加工干燥而成，性甘辛、温（也有医书提出蟾酥味为辛凉），有毒，能解毒、消肿、强心、止痛，治疗疮、痈疽、发背等症[16-17]。研究证实蟾酥抗癌有效成分多为脂溶性化合物，其中蟾毒灵，华蟾毒配基，酯蟾毒配基含量较多，活性较强，具有高效低毒的特点。现代药理研究表明其脂溶性成分不仅具有抗肿瘤的作用，同时还能增加机体对放化疗的耐受性，降低化疗药的毒副作用，并降低癌痛发生率和提高机体免疫力。本研究中关注的Bufalin是中药蟾酥的有效成分。Bufalin可通过抑制AKT的活化、上调p38的活化与紫杉醇协同抑制乳腺癌细胞增殖，诱导细胞凋亡[18-20]，还可通过抑制顺铂诱导的Met和Src活化，与顺铂协同抑制MCF-7细胞增殖[21]。此外，Bufalin可通过下调cFLIP和XIAP的表达增强TRAIL诱导的乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡[22-23]。这些研究均表明Bufalin可能通过多个靶点发挥抗乳腺癌作用。

本研究发现Bufalin能够上调乳腺癌MCF7细胞SLC19A3基因的表达。这个结果提示SLC19A3基因可能是Bufalin作用于乳腺癌的新靶点，并结合文献资料推测可能存在的新抗肿瘤机制。通过中药组分的基因表达谱资料探索药物的新机制和新靶点对于中医药研究人员来说是非常方便有效的方法。本研究包含了目前为止最大的样本量，并且所有数据均来自基因芯片，研究方法一致，因此极大地增加了结论的可信度，将为乳腺癌治疗药物的开发提供重要的理论依据和借鉴思路。后续有待于通过进一步的实验室和临床研究进行验证。

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