TP53基因在维吾尔族食管癌中的基因表型、蛋白表达及其与预后的相关性

阿不都沙拉木·阿不都热合曼 买地尼也提·尼亚孜 张海平 居来提·艾尼瓦尔 阿不都艾尼·吐尔洪 张力为 伊力亚尔·夏合丁 伊地力斯·阿吾提

[摘要] 目的 探讨维吾尔族食管癌组织中TP53基因缺失和p53蛋白表达状况及其与预后的相关性。 方法 选取2009年12月～2013年6月在新疆医科大学第一附属医院胸外科行根治性手术切除的维吾尔族食管鳞状细胞癌患者67例，应用荧光原位杂交技术检测其间期细胞核中TP53基因缺失情况，并通过免疫组化方法检测p53蛋白表达情况，分析TP53基因表型、蛋白表达与临床病理因素及术后生存期的关系。 结果 在食管癌高分化组中TP53基因的缺失率为15.00%，而在中、低分化组中为40.43%，差异有统计学意义（P < 0.05）；而TP53基因缺失在不同肿瘤浸润深度、不同淋巴结转移状态样本中的差异无统计学意义（P > 0.05）。p53蛋白表达在不同肿瘤分化程度、不同肿瘤浸润深度和不同淋巴结转移状态样本中的差异均无统计学意义（P > 0.05）。 结论 TP53基因缺失与食管癌肿瘤分化程度有一定的相关性，但与术后生存期关系不能确定，TP53基因缺失和p53蛋白表达尚不能作为评估维吾尔族食管癌患者预后的生物标志物，需要增加样本量进一步确定。

[关键词] 维吾尔族；食管鳞状细胞癌；p53；预后

[中图分类号] R739.45 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）06（b）-0017-04

[Abstract] Objective To study the TP53 gene deletion and p53 protein expression level in Uygur′s esophageal carcinoma， and its correlation with prognosis of Uygur esophageal cancer patients. Methods Sixty-seven cases of Uygur esophageal squamous cell carcinoma treated by radical resection from December 2009 to June 2013 in Department of Thoracic Surgery， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University were selected. TP53 gene deletion and p53 protein expression was detected respectively by fluorescence in situ hybridization and immuno-histo-chemistry methods. The relationship of TP53 gene deletion and p53 protein expression with clinicopathological factors and postoperative survival rate was analyzed. Results In the highly differentiated group， the deletion rate of TP53 gene was 15.00%， which of moderate and poorly differentiation group was 40.43%， the difference was statistically significant （P < 0.05）. There was no significant difference of the deletion rate of TP53 gene in different tumor invasion depth and lymph node metastasis status （P > 0.05）. There was no significant difference of the degree of p53 protein expression in different degrees of tumor differentiation， tumor invasion depth and lymph node metastatis status （P > 0.05）. Conclusion There is a certain correlation between TP53 gene deletion and the differentiation degree of esophageal carcinoma tumor， but the relationship with the survival has not been determined. The TP53 gene deletion and p53 protein expression level cannot be seen as the prognostic biomarkers of Uygur patients with esophageal cancer. Therefore， larger sample capacity is needed for in-depth exploration and determination.

[Key words] Uygur； Squamous cell carcinoma of the esophagus； p53； Prognosis

食管癌是世界常見的恶性肿瘤之一，中国是食管癌高发地，以鳞癌为主[1]。食管癌发病率和病因学因素存在着明显的地域性差异和种族差异[2]，新疆是多民族聚集区，也是食管癌高发地区，维吾尔族是食管癌高发民族之一[3]。食管癌发生发展与多基因、多因素有关，TP53基因是一种参与细胞周期调控的抑癌基因，其编码的野生型p53蛋白控制细胞周期的启动，防止突变基因出现遗传不稳定性和癌变[4]，与人类多数恶性肿瘤有关[5]。虽然p53蛋白过度表达经常被认为是一个对TP53基因突变的替代，但它与基因序列检测结果具有较高的假阳性和假阴性[6]。FISH技术检测出染色体突变和特定基因拷贝数改变而诊断恶性细胞的方法[7]，国内外研究已证实TP53基因缺失与食管癌的发生、发展有关[8-9]。但其在维吾尔族食管癌患者中的表型和表达鲜见报道。

本研究应用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术和免疫组化技术检测维吾尔族食管癌组织中TP53基因缺失和p53蛋白表达情况，并分析其在不同分化程度、不同肿瘤浸润深度及不同淋巴结转移状态样本中的差异，评估TP53基因在维吾尔族食管癌发生、发展中的作用及其与食管癌预后的相关性。

1 材料与方法

1.1 标本收集

收集2009年12月～2013年6月在新疆医科大学第一附属医院行食管癌根治术的维吾尔族食管鳞状细胞癌患者67例，其中男50例，女17例；根据世界卫生组织（WHO）第7版标准[10]进行病理学诊断，包括肿瘤分化、肿瘤浸润、肿瘤分期：67例患者中高分化20例，中度分化43例，低分化4例；T1和T2共19例，T3和T4共48例；区域淋巴结转移阳性36例，阴性31例；术后TNM分期Ⅰ期8例，Ⅱ期30例，Ⅲ期29例。

术后组织离体后取新鲜肿瘤组织和癌旁正常组织（距癌组织5 cm以外处）标本，新鲜肿瘤组织在载玻片上触贴式制作FISH检测标本，浸入10%中性甲醛，按照标准程序石蜡包埋。连续切片（4 μm）进行苏木精染色、免疫组化检测。本研究经医院伦理委员会批准，并获得患者的书面知情同意。

1.2 FISH方法

应用FISH方法检测TP53基因缺失突变情况，使用双色FISH探针即橙色荧光标记的LSI TP53探针和绿色荧光标记的17号染色体着丝粒探针（Cytocell Ltd，英国）。组织芯片在60℃烤片2 h后，将用二甲苯脱蜡和梯度乙醇溶液水化，空气干燥组织切片。在80℃ Vysis pretreatment solution中孵育15 min。用超纯水液洗涤后用Vysis protease Ⅰ溶液，在37℃中孵育10 min，并用超纯水洗涤，在冷乙醇溶液脱水（70%、80%、90%、100%各2 min）。滴加10 μL的杂交混合物后盖上盖玻片，用橡胶泥密封。用杂交仪变性杂交（变性条件：75℃，5 min；杂交条件：37℃，过夜）。次日，用（73±1）℃的2×SSC溶液洗涤2 min，再放入同样缓冲液在室温下洗涤1 min。

FISH评分：计数100个有荧光信号的不重叠细胞核，根据信号改变的细胞核百分比来计算。FISH阳性判别标准：正常细胞有两个红色和绿色信号，p53的红色信号为一个或零信号，并且缺失率在30%以上判定为缺失。

1.3 免疫组化染色方法

应用免疫组化方法检测p53蛋白表达情况，使用免疫组化Envision法对所有切片行p53染色标记，小鼠抗人p53单克隆抗体购自Sigma公司（美国）。免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。实验严格按说明书进行，一抗浓度1∶100，用0.01 mol/L PBS替代一抗作为阴性对照，用已知乳腺癌阳性组织切片为阳性对照。由2位病理科医师采取双盲法观察切片并诊断，结果一致则记录结果，如有争议，以2个相同意见为准。p53蛋白阳性标准：原发灶≥10%的癌细胞有明显的核棕黄色或棕褐色染色，包括一些黏膜的基底细胞层中≥10%的细胞有相应的p53特征染色为阳性。只限于基底细胞的很弱的染色被认为阴性[11]。根据阳性标本数量与总数的比例计算阳性率。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件包进行数据分析，计数资料比较采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TP53基因缺失和p53蛋白表达情况

p53蛋白的阳性细胞染色定位于细胞核，在67例食管鳞癌组织标本中的阳性表达率明显高于癌旁正常食管组织，差异有统计学意义（P < 0.05）。67例患者癌組织中TP53基因缺失率明显高于癌旁正常食管组织，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

67例食管鳞癌组织标本中，TP53基因缺失22例，其中18例p53蛋白阳性；TP53基因检测未缺失的45例样本中p53蛋白阴性31例，两种结果符合率为73.13%（49/67）。

镜下可见癌组织p53蛋白表达阳性与癌旁组织表达阴性，癌组织TP53基因缺失阳性与癌旁组织阴性，见图1（封四）。

2.2 TP53基因缺失和p53蛋白表达与临床病理因素的相关性

统计学结果显示，p53蛋白在不同肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度、病理分期和淋巴结转移人群之间的表达，差异无统计学意义（P > 0.05）。TP53基因缺失在不同肿瘤浸润深度、病理分期和淋巴结转移人群之间的差异无统计学意义（P > 0.05）。TP53基因缺失情况在高分化组与中低分化组之间比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

3讨论

食管癌是消化道常见肿瘤，手术切除目前仍是其最主要的治疗手段。由于大多患者诊断明确时已到中晚期，加之术后复发、转移等因素使食管癌预后不良[12]。因此，早期诊断、早期治疗是改善预后的关键因素。食管癌的发生是多步骤、多阶段基因异常累计结果，原癌基因激活、抑癌基因失活是肿瘤发生发展过程中重要的分子遗传学基础，TP53是目前发现的最重要的抑癌基因之一[13]，TP53基因缺失和突变情况常发生在食管癌早期阶段[14-15]，TP53基因缺失在食管癌的早期诊断中有一定应用价值[16]。

维吾尔族食管癌患者大多数是癌症中晚期才诊断明确的，其主要原因是患者出现症状时未及时到医院检查，其中一半患者在了解胃镜检查取病理的重要性以及可以行无痛胃镜检查的前提下，还是会拒绝行胃镜检查，而不能取病理明确诊断，还有部分患者胃镜取活检部位不准确而再次行胃镜检查时被患者拒绝，故本研究希望明确食管癌的早期诊断指标。

本研究中食管癌组织中TP53基因缺失率和p53蛋白表达均明显高于癌旁正常食管组织，结果分析差异有统计学意义，说明TP53基因缺失和p53蛋白表达与食管癌的发生有密切关系。p53蛋白阳性表达率为47.76%，TP53基因缺失率为32.84%，TP53基因缺失的比率小于蛋白表达率。这可能是因为基因多种突变方式都可引起p53蛋白表达异常，p53蛋白功能可以通过突变以外其他机制失活，此结果与国外发表的相关研究报道一致[17]。

p53蛋白陽性表达与维吾尔族食管癌患者肿瘤分化程度、肿瘤分期与病理分期等临床病理因素无相关性（P > 0.05），国内外有相同的研究结果[17-19]，也有不同的结果[20-22]，这可能与人群基因特点、样本量少、随机抽样误差等有关。

TP53基因缺失情况与肿瘤分化程度有关，高分化组中TP53基因缺失率为15.00%，在中、低分化组中为40.43%，分化程度低者，TP53基因缺失阳性率高（P < 0.05）。分化程度是影响食管癌预后的因素之一，TP53基因缺失情况与分化程度的关系提示其可能影响患者预后，需要扩大样本量进一步进行分析。

综上，本研究结果显示TP53基因缺失与食管癌肿瘤分化程度有一定的相关性，但与术后生存期关系不能确定，TP53基因缺失和p53蛋白表达尚不能作为评估维吾尔族食管癌患者预后的生物标志物，TP53基因缺失和p53蛋白表达在维吾尔族食管癌发生发展中的作用需要进一步研究。

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