缬沙坦对脓毒症大鼠心肌细胞凋亡的影响

(青岛大学附属医院重症医学科，山东 青岛 266071)

脓毒症是重症医学科的常见疾病，其发病率、病死率均居高不下[1-2]，是重症医学科医生经常要面对的挑战之一。细胞凋亡是脓毒症发生器官功能损伤的主要病理机制之一[3]，能够导致内皮细胞功能障碍、免疫紊乱等不良事件的发生[4-5]，其中心肌细胞过度凋亡是脓毒症心肌抑制的重要机制之一[6]。肾素血管紧张素系统(RAS)的激活在生理状态下是维持人体血流动力学稳定的重要机制，但越来越多的研究证实RAS的过度激活是脓毒症器官功能损伤的重要病理机制之一[7-8]，缬沙坦作为血管紧张素Ⅱ的Ⅰ型受体的拮抗剂(ARB)在脓毒症的治疗中已逐渐引起人们的重视。本研究拟使用盲肠结扎穿孔(CLP)法[9]复制脓毒症大鼠模型，通过苏木精-伊红(HE)染色观察脓毒症大鼠心肌病理损伤的变化，采用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记技术(TUNEL)检测大鼠心肌细胞凋亡指数的变化，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定大鼠心肌组织凋亡蛋白表达量的变化，以初步探讨缬沙坦对脓毒症大鼠心肌细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

健康雄性SD大鼠(青岛大任富城畜牧有限公司，许可证号：SCXKL鲁20140007)共50只，体质量280～330 g。采用随机数字表法分为对照组(A组)、假手术组(B组)、脓毒症组(C组)、小剂量缬沙坦组(D组)、大剂量缬沙坦组(E组)5组，每组10只大鼠。

1.2 各组的处理

A组大鼠不给予任何处理；B组大鼠开腹找到盲肠后立即还纳关腹，不予结扎穿孔；C、D、E组按照CLP法[9]制备脓毒症模型，术后自由进食水，严密观察大鼠的状态。A、B、C组在术后以生理盐水(10 mL/kg)灌胃。D组大鼠术后给予缬沙坦(规格为80 mg，北京诺华制药公司)溶液(以生理盐水溶解至5 g/L)灌胃，剂量为10 mL/kg，E组大鼠在D组基础上，术后6 h再次给予同等剂量的缬沙坦溶液灌胃。C、D、E组大鼠术后腹壁皮下注射生理盐水(30 mL/kg)，模拟液体复苏。

所有动物术后24 h再次麻醉，沿原腹部切口再次打开腹腔，观察腹腔感染的情况，向上纵行延长切口分离心脏，4 ℃生理盐水洗净血污，取一部分左心室游离壁组织保存于40 g/L多聚甲醛中待HE及TUNEL染色，剩余心肌组织保存于-80 ℃冰箱中备用。

1.3 检测指标

1.3.1术后大鼠生存情况 观察CLP术后各组大鼠的生存状态、应激反应、神经系统功能的改变，记录各组大鼠的病死率，CLP术后24 h内死亡的大鼠不纳入最终观察对象，及时补齐各组大鼠的样本量。术后24 h再次麻醉后开腹，观察腹肌的紧张度及腹腔液体的性状、腹腔感染和腹膜炎的程度。

1.3.2心肌病理学变化观察 心肌组织在多聚甲醛中保存72 h以上，流水冲洗5～12 h洗净甲醛，经梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋后制成蜡块，蜡块以5 μm厚连续切片，取形态规则的完整切片，用玻璃板捞出。置于60 ℃的电热恒温鼓风干燥箱中30 min烘干。经脱蜡、水化、HE染色，中性树胶和二甲苯(比例为3∶7)混合溶液封片后，光学显微镜下观察心肌显微结构的变化，并拍摄图片。

1.3.3细胞凋亡指数(AI)的检测 使用石蜡切片进行TUNEL染色，步骤严格按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(Alexa Fluor 488)(上海翊圣生物科技有限公司)说明书进行，载玻片封片后，于光学显微镜下观察心肌细胞凋亡情况，Image-Pro Plus分析各样本的AI。其中凋亡的细胞核呈棕黄色，正常心肌细胞核呈蓝色，即AI=视野内凋亡细胞核个数/视野内所有心肌细胞核个数，每个样本随机选取10个视野，计算出的AI取平均数计入结果。

1.3.4心肌组织凋亡蛋白含量的检测 电子天平称取0.07～0.09 g的心肌组织，按1∶10 000的比例加入组织裂解液(不超过1 mL)，使用手持式样品制备仪制备成组织匀浆后，于低温离心机中4 ℃下12 000 r/min离心15 min，取上清液用ELISA法检测心肌组织凋亡蛋白含量的变化。步骤严格按照大鼠B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)试剂盒以及大鼠半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)试剂盒以及大鼠P53蛋白(P53)试剂盒(均购自北京冬歌生物技术有限公司)说明书进行操作。

2 结 果

2.1 各组大鼠生存情况比较和腹腔感染程度

C、D组大鼠术后24 h均出现精神不振、蜷缩少动、嗜睡、对刺激反应降低等神经系统的症状，以及寒战等中毒症状，部分大鼠可见四肢脚爪青紫。E组大鼠同样具有上述感染中毒症状，但较少出现对刺激无反应和脚爪青紫等休克和微循环障碍的症状。

最终实验所用大鼠共65只，其中死亡15只大鼠，其中C、D、E组分别死亡7、5、3只大鼠，E组大鼠病死率与C组比较无显著性差异(P>0.05)，但呈下降趋势。

术后24 h C、D、E组大鼠可观察到腹部膨隆、腹壁张力增大，开腹后可闻及恶臭，见大量咖啡色渗出液流出，结扎的盲肠末端坏死发黑，与肠管大面积粘连，部分可见与壁层腹膜粘连，大网膜在盲肠局部包裹成团，其余肠壁充血水肿，伴部分肠管扩张。

2.2 各组大鼠心肌组织病理学变化

A、B组大鼠心肌组织结构正常，镜下可见心肌纤维排列紧密，无水肿、充血及炎症细胞浸润。C组与A、B组比较，心肌纤维明显水肿、排列疏松、明显空泡化改变，大量细胞核肿胀，可见核淡染、染色质聚集成块及核周间隙增宽，部分心肌纤维断裂，间质渗出明显、炎性细胞浸润。D组与C组比较心肌纤维、细胞核形态改善不明显。E组与C、D组比较心肌纤维水肿、空泡化减轻，间质渗出减少，结构排列较紧密，细胞核形态较C组改善，但仍然有肿胀。见图1。

2.3 各组大鼠心肌细胞AI、Bcl-2、Caspase-3和P53蛋白表达比较

C组大鼠心肌凋亡细胞数量明显增加，AI明显升高，与A、B组比较，差异有显著性(F=38.47，q=13.64、12.19，P<0.05)；而D组大鼠心肌凋亡细胞数略减少，AI也有下降趋势，但与C组比较无统计学差异(P>0.05)；E组大鼠心肌凋亡细胞数量明显减少、AI明显下降，与C组比较差异有显著性(q=9.68，P<0.01)；且与D组比较，E组的AI也明显下降(q=8.04，P<0.05)。见图2，表1。

A、B、C、D、E分别代表A、B、C、D、E组。HE染色，400倍。

A、B、C、D、E分别代表A、B、C、D、E组。TUNEL染色，400倍。

组别nAI(χ/%)Bcl-2(ρ/ng·L-1)Caspase-3(c/pmol·L-1)P53(ρ/ng·L-1)A组104.49±1.41105.77±7.1220.11±1.97204.82±13.81B组106.16±1.131110.61±5.3622.45±1.22236.87±21.48C组1020.08±6.5358.84±13.4334.46±5.03412.69±63.06D组1018.20±7.8970.96±8.7832.80±3.78386.87±61.55E组109.01±2.6086.46±19.9523.68±2.31287.62±37.01

C组大鼠心肌细胞中Bcl-2的表达量与A、B组相比较，明显降低(F=47.70，q=14.73、15.84，P<0.05)；与C组比较，D组大鼠心肌细胞中Bcl-2的表达量明显升高，差异具有统计学意义(q=4.25，P<0.05)；与D组比较，E组大鼠心肌细胞中Bcl-2的表达量升高更加显著(q=9.68，P<0.01)。见表1。

C组大鼠心肌组织中Caspase-3的含量与A、B组比较明显升高(F=80.33，q=19.93、16.43，P<0.05)；D组与C组比较，Caspase-3的表达量无统计学差异(P>0.05)；而E组与C、D组比较，心肌组织中Caspase-3的含量则明显降低(q=15.18、12.45，P<0.05)。

C组大鼠心肌P53蛋白的表达量与A、B组比较明显升高(F=74.15，q=19.75、16.71，P<0.05)；D组与C组比较，心肌组织中P53蛋白的含量无统计学差异(P>0.05)；而E组与C、D组比较，心肌组织中P53蛋白的含量则明显降低(q=11.68、8.96，P<0.05)。

3 讨 论

脓毒症是指严重感染导致的机体的反应失调，进而引发器官功能障碍[10]，目前已经成为重症医学科发病率、病死率最高的疾病之一。其发病机制可能与炎症因子的释放[11]、缺血再灌注损伤[12]、氧化应激损伤[13]等病理过程有关，这些病理损伤均可导致DNA损伤，激活各种细胞凋亡途径，促进免疫功能紊乱、组织细胞功能障碍的发生。抑制细胞凋亡可起到保护组织器官的作用[14]，CHUNG等[15-16]使用Fas受体融合蛋白阻断Fas信号通路的传导，发现可提高脓毒症小鼠的生存率，改善脓毒症时微循环灌注不足。

RAS是生理状态下维持血流动力学稳定、参与机体应激、促进细胞生长的重要调节系统，脓毒症患者常常因感染导致组织灌注不足、高热应激引起RAS系统的过度激活，导致血管紧张素Ⅱ(Ang2)大量释放入血，与血管紧张素Ⅰ型受体(AT1 receptor)结合，参与众多病理生理过程，是介导细胞凋亡重要的病理机制之一，AT1的抑制剂能够减少细胞凋亡，发挥器官保护作用[17]。ARB能够抑制Ang2与AT1的结合，研究结果证实ARB类药物可在肝脏[18]、肺泡上皮细胞[19]、肠黏膜[20]等组织器官中发挥器官保护作用，一项纳入3 180例脓毒症患者的临床研究证实，应用ARB类药物能够明显降低脓毒症患者的30 d病死率[21]。本研究选用缬沙坦阻断Ang2与AT1的结合，探讨ARB类药物在抑制细胞凋亡方面的作用机制。

感染所致的急性腹膜炎是脓毒症的常见病因，致病菌主要为大肠杆菌，约占59.7%[22]。CLP法通过盲肠结扎穿孔模拟腹腔感染、急性腹膜炎的病理过程，是最符合脓毒症病理过程的实验方法，与腹腔注射脂多糖比较更符合脓毒症的发病机制、血流动力学变化及代谢的变化[23]。根据文献报道，CLP术后24 h时心肌损伤最明显[24]，本实验结果显示，C、D、E组大鼠术后24 h出现腹肌紧张、腹部张力明显增大等表现，开腹可闻及粪臭味，并见大量浑浊的渗出性液体及肠内容物，肠蠕动减弱，结扎的盲肠末端变黑、充血坏死，表明脓毒症造模成功。各实验组大鼠腹腔感染、腹膜炎的严重程度一致。

HE染色是最常用的观察心肌纤维结构变化、病理损伤的方法。本实验结果显示，C组大鼠心肌纤维正常结构破坏、排列紊乱，大量细胞核形态异常，间质渗出，炎症细胞浸润，提示脓毒症大鼠心肌显微结构破坏严重，CLP腹腔严重感染导致了心肌损伤的发生。D组与C组比较心肌纤维、细胞核形态改善不明显。E组与C组比较，心肌纤维结构相对正常，排列规则，纤维空泡形成、间质渗出明显减少，心肌损伤明显减轻，表明大剂量缬沙坦能够明显改善脓毒症大鼠心肌纤维结构，减轻病理损伤。

细胞凋亡时DNA核酸内切酶被激活，切割核小体间的基因组，暴露3′-OH末端，TUNEL染色[25]在末端脱氧核糖核苷酸转移酶(TdT)的作用下，将Alexa Fluor 488-12-dUTP结合到暴露的3′-OH上，识别凋亡细胞，通过DAP显色液可以观察到凋亡的或正在凋亡的细胞核为棕黄色，正常的细胞核被苏木素染成深蓝色。本研究通过TUNEL染色对HE染色的石蜡切片进行半定量分析，C组与A、B组比较，心肌细胞凋亡指数明显升高，表明脓毒症时细胞凋亡是心肌损伤的重要病理机制之一，对比D组、C组的凋亡指数表明小剂量的缬沙坦就可脓毒症心肌细胞凋亡的作用并不明显，而通过对比E组与D、C组心肌细胞的凋亡状态，证实大剂量缬沙坦抑制细胞凋亡的作用更加显著。

Caspase-3是细胞凋亡的执行者，是外源性凋亡途径、线粒体凋亡途径、内质网凋亡途径的交汇点，通过识别和切割抗凋亡蛋白氨基酸序列、水解DNA核酸内切酶抑制因子，增强DNA内切酶的活性，促进细胞凋亡的发生[26-27]。P53是另一种重要的凋亡调节蛋白，当组织细胞轻度损伤时，能够修复受损的DNA片段，稳定染色体结构，而当组织细胞发生严重的功能障碍、能量代谢障碍时，细胞损伤难以逆转，P53将会通过活化FasL调控外源性凋亡途径，激活Bax调控线粒体凋亡途径，发挥促进细胞凋亡的作用[28]。

本实验结果显示，C组较A、B组大鼠心肌组织中Caspase-3、P53的含量明显升高，表明脓毒症时大鼠心肌细胞中促凋亡蛋白的表达量明显增加，从而发挥强大的促凋亡作用，加速心肌细胞凋亡的进程。D组与C组比较，Caspase-3、P53的含量未见明显降低，表明小剂量缬沙坦抑制促凋亡基因表达的作用并不明显，不能抑制心肌细胞凋亡。而E组与C组比较，心肌组织中Caspase-3、P53的含量明显下降，证实了大剂量缬沙坦能够通过减少促凋亡蛋白的含量，发挥抑制凋亡的作用。

Bcl-2家族的激活可参与线粒体凋亡途径，主要分为抗凋亡基因(如Bcl-2、Bcl-xl等)和促凋亡基因(如Bax、Bid等)[29]。因此Bcl-2家族调控细胞凋亡的机制主要取决于哪种凋亡基因的表达更占优势，Bcl-2能够抑制细胞色素C从线粒体释放至细胞内，抑制细胞凋亡的发生。本实验结果显示，C组Bcl-2蛋白的含量较A、B组明显降低，表明脓毒症时心肌细胞中抗凋亡蛋白的表达降低，而D组心肌细胞中Bcl-2的含量较C组明显升高，表明小剂量的缬沙坦就可增加细胞中Bcl-2的表达。但E组Bcl-2的含量较C、D组均明显升高，证实了与小剂量缬沙坦相比，大剂量缬沙坦更能明显增加抗凋亡蛋白的表达。

综上所述，脓毒症时大鼠心肌细胞发生严重的细胞凋亡，导致心肌损伤加重。而缬沙坦能够抑制RAS系统的活性，减轻脓毒症心肌细胞凋亡，发挥器官保护作用，这可能是通过抑制促凋亡蛋白的表达，增加抗凋亡基因的转录，抑制了三种细胞凋亡通路的激活，降低凋亡执行者Caspase-3的含量实现的，但这一过程与缬沙坦的剂量密切相关，具体的使用剂量仍需大量实验研究探索，抑制细胞凋亡或将成为脓毒症治疗的关键。