胶原蛋白海绵对拔牙创愈合过程中基因ALP表达的影响*

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(1.山东省口腔组织再生重点实验室，山东 济南 250012；2.山东大学口腔医学院，山东 济南 250012；3.泰山医学院附属医院口腔科，山东 泰安 271000；4.泰山医学院口腔医学院，山东 泰安 271000)

牙槽骨的骨量及位点保存是种植义齿修复最为关键的工作，如何预防拔牙后牙槽嵴吸收，保证拔牙后有足够的骨量来进行种植牙尤为重要[1]。而且拔牙术后牙槽窝骨愈合较慢，严重影响患者对美观及早期功能恢复的要求。因而，探索一种简便操作，可有效减少骨吸收，缩短修复等待时间的方法极为迫切。胶原蛋白海绵有良好的生物相容性、较强的止血效果及吸附功能，便于局部沉积钙离子和磷酸根离子，能为拔牙后骨腔的血块凝集提供足够的立体空间，可有效地促进成骨。目前临床中普遍采用胶原蛋白海绵填塞颌骨囊肿手术后的骨腔及埋伏牙骨腔取得良好的止血效果，同时囊腔成骨速度也明显提高[2]。关于胶原蛋白海绵促进牙槽窝愈合的实验研究相继被报道，但缺乏基因水平研究[3]。本实验旨在研究胶原蛋白海绵植入对牙槽窝组织成骨相关基因ALP的早期表达水平变化的影响，进一步从分子水平为胶原蛋白海绵的临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物和材料

健康雌性SD大鼠16只，4周龄，体重约(250±12.5)g左右，饲养于泰山医学院动物实验中心，口腔检查无疾患，饮食活动正常。胶原蛋白海绵采用倍菱牌，购自北京益而康生物开发中心。

1.1.2主要试剂及设备

实时定量PCR试剂盒qPCR Mix (Bio-Rad公司)，反转录酶试剂盒 Goscript (购自 Promega 公司)，RNA提取应用Trizol试剂盒(购自Generay生物公司)。武汉塞维尔科技有限公司合成ALP基因，上游引物：5'-GGATCAAAGCAGCATCTTACCAG-3'，下游引物：5'-GCTTTCCCATCTTCCGACACT -3'；GADPH基因上游引物：5'-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3'，下游引物：5'-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3'。主要设备定量PCR仪为Stepone plus (ABI,美国)，台式高速冷冻型微量离心机D3024R (DragonLab,中国)。

1.2 方法

1.2.1动物模型建立

用10%水合氯醛将SD大鼠麻醉后，仰卧位固定于手术台上，术区采用碘伏消毒，分离右侧上颌第一磨牙牙龈，用口腔探针的三弯端从上颌第一磨牙腭侧插入根分叉，轻轻撬动，直至牙齿松动脱位，将胶原蛋白海绵放入牙槽窝，至骨水平，缝合固定。左侧为对照侧，同法拔除上颌第一磨牙，复位缝合，缝线均采用5-0可吸收缝线，均缝合一针。注意观察大鼠呼吸，避免窒息。老鼠术后复苏良好，饮食活动正常。分别在术后1周、2周、4周、8周各处死老鼠4 只，取老鼠拔牙窝的牙槽骨及肉芽组织，进行基因检测。

1.2.2实时定量PCR检测成骨相关基因ALP表达

按照试剂盒操作步骤，对样本进行RNA提取，反转录后得到cDNA，置于冰箱，-20 ℃保存。之后运用实时定量PCR法测定ALP基因表达情况。采用2-△△CT法计算实验组与对照组ALP基因的表达差异。

1.3 统计学处理

2 结 果

ALP基因在实验侧组织及对照侧组织中均有表达，术后1周、2周、4周、8周，实验侧组织中ALP基因表达相对定量分别为(6.41±0.63)，(10.76±0.46)，(4.46±0.65)，(1.75±0.45)，均显著高于对照侧组织(P<0.05)，术后ALP基因相对定量分析结果见表1。

表1 术后基因ALP表达的定量PCR分析结果

3 讨 论

拔牙创的愈合实际上是一个骨组织的修复再生的动态过程，该过程较慢，通常拔牙术后需要3个月之久新生骨才能达到吸收的牙槽嵴顶水平[1]，因此预防拔牙后牙槽嵴吸收，加速骨组织的修复再生过程，对于各种后续牙科操作具有重要的临床意义。 目前国内外关于如何避免拔牙后牙槽骨吸收的研究越来越受到关注。Wang等[4]主要从微创拔牙、处理牙槽窝骨壁获得充足血液、骨移植材料填入牙槽窝内2/3深度、创伤敷料填充剩1/3深度、8字缝合牙槽窝、应用卵圆形义齿帮助牙龈成形。Fowler等[5]推崇“Bio-Col technique”技术，也是在微创拔牙的基础上，固有牙槽骨壁凿孔出血，Bio-oss充填，放置 Collaplug缝合等。而Landsberg[6]通过采用拔牙窝内骨移植及拔牙窝顶软组织移植的牙槽窝封闭术进行临床试验，取得了良好效果。2009年Simon等[7]对自体富血小板纤维蛋白基质的研究发现植入自体富血小板纤维蛋白基质的牙槽窝愈合速度更快，即使不用生物膜也能取得较好的效果。生物膜的应用对拔牙后骨缺损病例进行植骨盖膜，可有效促进缺损骨修复。Lasella等[8]对异种骨加胶原膜进行牙槽骨保存的实验，术后7个月，实验组成骨比例明显高于对照组。尽管这些研究取得了明显效果，可是因手术的复杂性、植入材料及生物膜的高昂价格等诸多因素限制，难以在临床广泛应用。

胶原是动物体内含量最多的蛋白质，也是器官中结缔组织的主要成分。研究表明，胶原和其他蛋白质相比不易引起抗体产生，所有从哺乳动物分离提取的Ⅰ型胶原非常相似，因而不易被人体免疫系统作为外体识别。胶原蛋白海绵在体内可以降解成无毒天然产物。再者，胶原蛋白海绵具有易于加工、灭菌和保存等独特的优势，被视为最有用途的生物材料，早已广泛应用于止血、组织缺损充填修复以及组织工程支架等领域[9-11]。胶原蛋白是骨组织主要成分之一，可加速骨修复，它能够为组织钙化提供必需的的三维结构，而且位于其表面的骨钙素结合位点，对矿物沉积有一定诱导作用，可促进新骨的形成[8]。朱晓琴等[3]通过建立兔拔牙模型，通过骨密度检测和组织学检查初步证实胶原蛋白海绵填入拔牙创能促进牙槽窝的早期骨愈合。本实验在其研究基础之上，运用实时定量PCR技术进一步探讨胶原蛋白海绵填入拔牙创后促进牙槽窝早期骨愈合的分子机制。通过建立大鼠拔牙模型，选取拔牙术后 1、2、4、8周作为研究时间点，实时定量PCR检测成骨相关基因 ALP的表达，发现拔牙后填充胶原蛋白海绵的实验侧组织ALP表达上调，该结果与目前文献中报道的成骨诱导剂处理拔牙创组织相关成骨基因表达水平变化较为一致。

综上，本研究从分子水平证实胶原蛋白海绵填塞拔牙创后ALP基因显著上调，促进成骨效果明显，为探索胶原蛋白海绵促进成骨的机制研究提供了初步的参考资料，本课题计划未来采用基因芯片技术进一步探索胶原蛋白海绵填充对于拔牙创愈合过程中相关基因的表达变化情况，深入探索胶原蛋白海绵促进成骨的分子机制。