酪蛋白糖巨肽（GMP）的研究进展

李委红，刘会平，孙娜新，陈沛，刘少娟，刘旭辉

（食品营养与安全国家重点实验室，教育部食品营养与安全重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

0 引 言

乳制品是优质蛋白质的良好来源，其消化率远高于植物蛋白质，牛乳中的蛋白质质量分数为3%～4%，其中80%以上为酪蛋白。Waugh等[1]于1956年发现了酪蛋白中唯一含有糖成分的蛋白质，即κ-酪蛋白。随后Delfour等[2]发现，凝乳酶能特异性水解牛乳κ-酪蛋白中苯丙氨酸105-蛋氨酸106的酰胺键，生成不溶性的副κ-酪蛋白（1～105部分）和三氯乙酸（TCA）可溶性的酪蛋白糖巨肽（106～169部分）。副κ-酪蛋白存在于凝乳中，溶解于乳清中的GMP则一同被排出，因此乳清粉是GMP的重要原料。

酪蛋白糖巨肽（Casein glycomacropeptide，GMP或CGMP）是一种含有唾液酸（Sialic acid，SA）的活性糖基磷酸肽，其多样化的生物功能活性主要与肽链上糖基和磷酸基团的不同有关[3]。目前，人们对GMP的分离纯化方法及抗感染、抗炎、调节肠道微生物菌群等生物活性进行了较为深入的研究。

1 GMP的结构及特点

在牛乳GMP的11种遗传变异型中，以A、B型最为重要，两者的区别在于第136位和第148位氨基酸种类不同，A型为苏氨酸136和天冬氨酸148，而B型为异亮氨酸136和丙氨酸148[4]。GMP主链上的丝氨酸127,149为磷酸化位点，5种糖基（见表1）通过O-糖苷键与丝氨酸或苏氨酸共价连接，且糖链中富含SA[3-5]。

表1 GMP的糖链组成

酪蛋白糖巨肽几乎不含苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸，含有较多的支链氨基酸（如缬氨酸和亮氨酸），可用于苯丙酮酸尿症患者（不能代谢芳香族氨基酸）和肝脏病患者的膳食中和修饰蛋白浓缩物[6-7]。GMP无二级结构，p I较低，亲水性比其他乳清蛋白高，在酸性条件下含有净负电荷，且具有热稳定性和可溶性。GMP含有大量具有生理活性的SA，且其复杂的糖肽结构赋予GMP多样化的生理功能性。

2 GMP的制备及分析方法

2.1 GMP的制备

乳清粉和牛乳酪蛋白是制备GMP的重要原料，相比酪蛋白，乳清粉在分离纯化前无需酶解，研究者们更青睐于以乳清粉为原料来获得GMP。

2.1.1 沉淀法

沉淀法主要包括冷乙醇沉淀、(NH4)2SO4沉淀和TCA沉淀，利用GMP的热稳定性和沉淀法可从乳清粉中获得GMP。Rojas E等[8]对乳清粉进行90℃热处理，沉淀离心后的产品平均回收率为34.08%；吴疆[9]分别利用TCA和硫酸铵二次沉淀分离得到GMP，硫酸铵沉淀法得到的GMP纯度为85.07%。

2.1.2 层析法

层析法主要包括离子交换法、凝胶过滤色谱、亲和层析和疏水色谱等，可获得产品纯度及SA含量均较高的GMP。Nakano等[10]利用丙烯葡聚糖凝胶S-200色谱先后在p H=7.0和p H=3.5条件下纯化GMP，提纯后的GMP占酪蛋白酸溶液干重的5.6%；Sliva-Hernandez等[11]利用阴离子交换和疏水作用色谱法从山羊甜乳清提取GMP，得率为0.6 g/L；陈绪卓等[12]将乳清粉经TCA沉淀及IRA93离子交换树脂处理后，GMP得率在74%左右；刁瑞丽等[13]利用优化得到阴离子交换树脂分离工艺，从100 g乳清粉中得到1.45 g GMP（SA含量为10.4%）。层析法虽然分离效果较好，但高成本使其难以推广到产业化生产过程中。

2.1.3 超滤法

利用不同pH值下GMP分子量具有差异性这一特性，可选用适当截留分子量的超滤膜分离GMP。将干酪乳清pH值分别调至3.1和6.7，先后过20 kd和5 kd的超滤膜，可获得纯度较高的GMP。马岚[15]和赵浩宇等[16]

先利用无水乙醇使大部分杂蛋白沉淀（可降低料液粘度，提高超滤效率），再将上清液进行超滤，得到的CGMP纯度分别达到92.45%和92.62%；张秀媛等[17]

采用超滤法得到相对较纯的GMP，蛋白质回收率为1.77%；曹荣安等[18]通过单因素和正交试验确定了GMP的超滤和纳滤工艺参数，在最优工艺下GMP纯度可达74.50%。膜过滤技术和离子交换色谱均能有效分离纯化GMP，因此研究者常结合两种方法从干酪乳清、酶凝干酪乳清和WPC原料中分离GMP，可以达到较好的纯化效果。Kreuβ等[19]利用阴离子交换膜吸附色谱法进行GMP半规模化生产，经超滤后产品纯度达91%；胡赞扬[20]和王子波等[21]

利用超滤和离子交换层析制备的GMP纯度分别为83.97和96.56%。膜分离法操作简便，较适用于工业化生产，但膜污染问题制约了该方法的广泛应用。

2.1.4 双水相系统法

双水相系统法是根据生物分子在双水相体系中选择性分配来达到分离的目的。Silva等研究证明16%聚乙二醇（PEG）1500+11.43%磷酸钾（p H=7.0）和15.0%PEG 1500+18.9%柠檬酸钠（pH=8.0）双水相系统的GMP回收率分别为93.95%和95%[22-23]；Wu等[24]利用18%PEG 6000+15%硫酸铵双水相系统的蛋白回收率为69.2%。此方法虽然GMP回收率高，但存在产品纯度低、浪费水资源的问题。

2.1.5 壳聚糖法及其他

壳聚糖为弱碱性，表面带正电荷，将壳聚糖小球加以修饰后可用于分离GMP。Li C等[25]利用β-环糊精修饰壳聚糖，可将GMP的吸附量增至90.23%；闫亚丽等[26]在壳聚糖法分离GMP的最佳工艺条件下可回收83.3%的GMP（SA质量分数为10 mg/g）。王艳萍等[27]在最佳酶解条件下酶解酸凝干酪素，此方法的GMP得率为17.91 mg/g；Tolkach[28]结合酶联技术和膜分离技术分离CMP及乳清蛋白，且分离效果较好；李博智等[29]利用谷氨酰胺转氨酶结合微滤技术得到纯度为70%的GMP；Kim等[30]利用基因工程法获得相应的GMP粗品，在超滤和离子交换层析后得到重组人乳GMP纯度高达94%以上。

2.2 GMP的分析方法

由于乳源GMP有多种变异体，故迄今为止还没有非常成熟的直接测定方法，只能进行定性和间接定量分析。

2.2.1 比色法

GMP几乎不含芳香族氨基酸，因此在普通蛋白检测波长280 nm处无吸收峰且考马斯亮蓝法无法对其质量分数进行测定。GMP仅在205～217 nm范围内可检测到吸收值，因此经常用OD280/OD210的值来间接反映GMP的纯度[20]。虽然比色法操作便捷，但准确度不高。

2.2.2 间苯二酚-盐酸法

GMP中含SA的的结合糖链高达90%以上，因此检测其包含的SA质量分数可间接反映样品中GMP的质量分数。间苯二酚-盐酸法是测GMP中SA质量分数的常用检测方法，其能够同时测定游离和结合的SA，但特异性和灵敏性都较低[31]。

2.2.3 电泳法

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是测定蛋白分子量的常用方法，但是此方法仅适用于检测多聚体的GMP且不能检测到大多数含唾液酸的GMP，因此误差较大[32]。此外，利用SDS-尿素凝胶电泳和醋酸纤维素（CAS）电泳也可得出GMP的大致分子量和质量分数。

2.2.4 高效液相色谱法

利用反相高效液相色谱法可以进行GMP成分及SA质量分数的分析[33]；闫亚丽等[34]对多种常用的GMP检测方法进行了比较分析，并认为高效液相色谱法具有纯度误差小等优点；Molle等[35]在检测GMP时采用色谱—质谱联用技术，定量地测出GMP的总量。虽然反相高效液相色谱与质谱联用是检测GMP较有效的方法，但仍然无法获得完整的GMP图谱。

2.2.5 氨基酸组成测定法

蛋白质和多肽均有特定的氨基酸组成，因此通过测定样品的氨基酸组成，将结果同其理论值对比后即可确定样品纯度。Thoma等[36]利用氨基酸分析仪测定了GMP氨基酸组成，并将氨基酸摩尔质量与理论值进行对比，最终算出产品纯度。

3 GMP的生理活性

GMP的生物活性和营养特性均较为丰富，在药品、保健食品等领域应用前景较为广阔。

3.1 调节免疫系统应答及抗炎

当机体受到抗原刺激时，免疫系统会通过一系列的生理反应以清除抗原，从而维持内环境的稳定，即为免疫系统调节。GMP抑制结肠组织细胞的凋亡，诱导小鼠肠黏膜产生获得性免疫应答，缓解溃疡性结肠炎[37-38]。Muñoz等[39]发现GMP可通过抑制Th2型免疫应答缓解过敏性皮炎及瘙痒症状；Sawin等[40]证明GMP可降低脱硫孤菌属（与炎症性肠病的发病机制和生成硫化氢细胞毒性化合物有关）、增加短链脂肪酸（可增强肠屏障功能和降低p H值），从而发挥肠道抗炎作用；Cheng X等[41]提出GMP木瓜蛋白酶酶解物可抑制脂多糖与Toll样受体-4/髓样分化蛋白2复合体结合，阻断巨噬细胞中核因子-κB通路，抑制脂多糖刺激性炎症反应，且效果显著优于GMP本身。

3.2 抑制细菌和病毒粘附

GMP与受体的高相似性有利于阻止病毒或细菌结合受体，进而抑制病毒或细菌在宿主细胞定植。Kawasaki等[42]发现GMP对流感病毒红细胞凝集具有抑制作用，而且唾液酸在GMP与流感病毒的反应中起着不可或缺的作用；Dosako等[43]发现GMP可以抑制Epstein-Barr病毒诱导的外周血淋巴细胞的形态改变；Zhang&Shapiro[44]发现木糖醇与GMP具有协同效应，不仅可以防龋齿还能重新矿化牙齿；刘鹏[45]证明其制取的GMP粗提物对变形链球菌有较高的抑制率，在质量浓度为12 mg/mL时可达88%。

3.3 结合大肠杆菌毒素及霍乱毒素

霍乱毒素是霍乱弧菌产生的外毒素，其亚单位B一旦与细胞壁上寡糖结合后，A亚单位活化细胞的腺普酸环化酶，会使细胞失水，从而引起腹泻。Oh等[46]证实糖基化GMP可以通过结合霍乱毒素来抑制毒素与受体结合；Isoda等[47]发现GMP可以抑制大肠杆菌肠毒素（LT-I及LT-II）与中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1）的结合；Rong等[48]通过体外实验发现GMP可以显著缓解由大肠杆菌感染引起的生长性能下降和腹泻，抑制仔猪肠道炎症。

3.4 促进肠道益生菌的增殖

N-乙酰葡糖胺或寡糖末端有N-乙酰葡糖胺的结构可促进双歧杆菌生长。Gyorgy等[49]发现GMP经唾液酸酶水解后会暴露出次末端的N-乙酰葡糖胺，从而能促进双歧杆菌生长。任效东等[50-52]研究了GMP对小鼠肠道菌落环境的影响，实验证明GMP具有调控和促进肠道双歧杆菌等有益菌，同时抑制肠杆菌、肠球菌等致病菌的作用，乳源GMP可通过调节失衡的肠道菌群来改善结肠炎；李楠等[53]提出GMP酶解物对歧杆菌的促生长效果优于GMP本身，且有效成分可能是水解产生的多肽类物质。

3.5 抑制胃肠道分泌物

GMP会刺激小肠黏膜分泌缩胆囊素（可抑制胃酸等的分泌）[54]，胃液分泌量的减少可使活性分子（溶菌酶、免疫球蛋白和乳铁蛋白等）不被胃过多消化，完整地进入小肠并被高效吸收，从而达到有效保护胃肠道的效果。通过动物实验发现饲喂或灌胃GMP可以在1～2 h内明显抑制胃液分泌，但静脉注射GMP无抑制胃分泌或改变胃肠激素血浆水平的作用[55]。

3.6 调节脂肪代谢

科学家们运用基因工程技术从酿酒酵母菌上得到了重组人GMP，实验表明此GMP是通过增加脂肪排出量的方式调节脂质代谢、预防脂质堆积和肥胖[30]。刘雪姬等[56]经实验证明调控肠道菌落微环境可以降低高脂饮食所引发的代谢性疾病发病率；成雪等[57]通过脂肪细胞与巨噬细胞共培养体系发现GMP酶解物对脂肪组织炎症的抑制作用显著；Xu等[58]提出GMP对小鼠由高脂肪饮食引起的肥胖有改善作用，可促进脂肪分解代谢，减少脂肪堆积。上述研究为GMP可调节脂肪代谢及肥胖相关炎症提供了理论基础。

3.7 抑制糖尿病、抗氧化等活性

Song等[59-60]发现GMP酶解物可以对二肽基肽酶-4产生抑制作用，且IPPKKNQDKTE肽段可通过AMP依赖的蛋白激酶活化作用调控胰岛素受体底物-1/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路，改善Hep G2细胞由高糖引起的抗胰岛素性，对抑制糖尿病方面有潜在作用；Li等[61]发现GMP酶解物可通过上调HepG2细胞内的HO-1的表达来缓解细胞氧化应激损伤；在含β-乳球蛋白食物的体外消化过程中若存在GMP，可显著减少β-乳球蛋白与免疫球蛋白结合，降低β-乳球蛋白潜在过敏性[62]；GMP还具有促进矿物质吸收、促进智力、抗血栓等作用。

4 结语

相比国外，国内关于GMP的分离纯化及生物活性研究较落后，国外已经将GMP应用于牙膏、饼干、饼干、婴幼儿食品及医药制品中。近些年，我国对GMP的生物功能研究正逐步全面化，至今已已对其免疫调节、抑菌、抗血凝、调节胃肠道、抗氧化等活性进行相关研究。由于GMP在乳清粉中的含量较低，提取率不高，结构复杂，目前并没有经济有效的适合规模化生产GMP的分离纯化方法，因此在国内并没有实现市场化。GMP的独特结构和生物功能具有极高的研究价值，随着科技技术的发展，GMP将会在国内逐步实现工业化，并应用于食品、药品及化妆品领域。