美拉德反应对褐色益生菌羊乳饮料品质的影响

刘婕，姜竹茂，刘晓，单静，艾春梅

（烟台大学生命科学学院，山东烟台，264005）

0 引 言

羊奶业是我国奶业的重要组成部分，是部分地区经济发展的重要支柱产业[1]。羊奶被称为“奶中之王”，营养组成和功能作用与母乳相接近，具有独特的生物活性性质，乳脂肪球和酪蛋白胶粒较小，更易于人体消化吸收，可作为牛乳治疗营养不良儿童的最佳替代品[2-3]。褐色乳酸菌饮料是一种风味独特、口感清爽的乳饮料，是脱脂牛乳与还原糖在高温杀菌的过程中发生了一定程度的美拉德反应而呈现褐色，再经用干酪乳杆菌或其他益生菌长时间发酵、破乳、调配、均质、灌装等而制成的一种发酵型乳酸菌饮料[4-5]。益生菌是一类能对人和动物产生有益作用，可以改善肠道微生物平衡，促进肠道健康，从而提高宿主的免疫调节功能[6-9]。目前我国羊奶产品较为单一，主要以传统的液态羊奶为主。鉴于褐色乳酸菌饮料市场需求，将羊奶的营养功能和益生菌的保健功能相结合，开发出具有保健功能的褐色益生菌羊乳饮料具有重要意义。

美拉德反应是游离氨基酸、多肽或蛋白质的氨基与还原糖的羰基之间发生的一种复杂反应，其反应产物包括挥发性香气物质、Strecker醛类物质和大分子质量棕黑色聚合物，这些产物在食品风味的形成中起着重要作用[10]，是广泛存在于食品工业的一种非酶褐变。美拉德反会产生各种特殊的风味物质，形成特殊的焦糖风味和色泽，同时还具有抗氧化等特点[11-14]。发生美拉德反应的过程十分复杂，其反应受到还原糖种类、氨基化合物、温度、时间、p H、水分、金属离子等多重因素的影响[15-16]，因此美拉德反应的程度对产品的品质有很大的影响。但是在美拉德反应过程中会损失蛋白质和氨基酸，甚至反应条件控制不当可能会产生有害有毒物质，比如，蛋白非酶糖基化会产生一种棕黄色的美拉德反应末端产物AGEs，这种物质会增加炎症，诱导氧化应激反应，可以造成糖尿病并发症的发生与发展[17-19]。因此本实验主要研究了羊乳与不同的还原糖在不同温度、不同加热时间下美拉德反应的程度，通过响应面设计试验选择出最佳的美拉德反应条件，为褐色益生菌羊乳饮料的研究与发展提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

纯羊奶，市售；葡萄糖、果糖，西王药业有限公司；果葡糖浆，山东香驰健源生物科技有限公司；白砂糖，市售；干酪乳杆菌，润盈生物（上海）有限公司；柠檬酸钠，山东柠檬生化有限公司；稳定剂，丹尼斯克（中国）有限公司。

1.2 仪器与设备

1.3 方法

1.3.1 加工工艺

1.3.2 操作要点

（1）褐色发酵基料的制备：纯羊奶脱脂后，加入一定量的还原糖，60℃搅拌15 min使其充分溶解，经60℃、20 MPa均质后，置于95～98℃水浴中进行褐变杀菌120～180 min，降温至36～38℃，添加4%干酪乳杆菌，混匀后发酵70～72 h，待发酵酸度达到180°T时终止发酵，冷却后，4℃冷藏10～12 h，备用。

（2）褐色益生菌羊乳饮料的制备：用70～80℃净化水溶解稳定剂与白砂糖，高速搅拌使其充分溶解，95℃、15 min杀菌后冷却至30℃，与褐色发酵基料混合。用柠檬酸钠将其pH值调整至3.6～3.8，酸度控制在60～68°T，调酸调香后经20 MPa、25℃均质，再经113℃、5 s杀菌，灌装，2～6℃冷藏，即得成品。

1.3.3 单因素试验

选择葡萄糖、果糖、果葡糖浆三种还原糖，考察它们对褐色益生菌羊乳饮料品质的影响，通过黄蓝值和感官评价确定最佳的还原糖；进而考察还原糖添加量（6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%）、褐变温度（86℃、89℃、92℃、95℃、98℃）、褐变时间（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min）等三个因素对褐色益生菌羊乳饮料品质的影响，并进行感官评价和测定其黄蓝值。

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1.3.4 响应面优化试验

根据单因素试验结果，利用Box-Behnken组合试验设计原理[20-21]，选择果糖添加量、褐变温度、褐变时间为影响因素，以黄蓝值、感官评价为评价指标，利用Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行处理，确定最佳的褐变工艺条件。试验因素和水平见表1。

表1 响应面试验因素水平表

1.3.5 评价指标

（1）黄蓝值的测定

美拉德反应产物呈现黄褐色，是食品风味的主要来源之一。测定褐色益生菌羊乳饮料样品的黄蓝值可以表示产品中黄褐色产物的相对浓度，进而比较产品的美拉德反应程度。样品黄蓝值越高，美拉德反应相对越充分，产品的风味越浓郁[22]。

（2）感官评价

随机选自10名食品专业人员对产品进行评定，对褐色益生菌羊乳饮料按表2评定标准进行感官评定[23-24]。

表2 褐色益生菌羊乳饮料感官评价标准

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 还原糖种类的确定

糖是美拉德反应重要的影响因素之一，糖的种类和结构不同会产生不同的反应速度，同时也产生不同的风味物质和色泽[25]。本研究选择了常见的三种还原糖（葡萄糖、果糖、果葡糖浆）进行美拉德反应。由图1可知，还原糖的种类对褐色益生菌羊乳饮料的品质和色泽影响较大。果糖的感官评分最高，果葡糖浆次之，葡萄糖最差。果糖的黄蓝值也最高，颜色的变化也最大，即美拉德反应程度最强，果葡糖浆次之。由于果糖溶解度高，温度越低，甜度越大的特点，更适合于褐色益生菌羊乳饮料，所以选择果糖作为最佳还原糖来进行美拉德反应。

2.1.2 还原糖添加量的确定

美拉德反应主要在羰基化合物（还原糖类）和氨基化合物（氨基酸和蛋白质）之间发生缩合、脱水、降解、聚合等一系列的反应[26]，因此还原糖的添加量对风味物质的产生有重要的影响。由图2可知，随着果糖添加量的增加，褐色益生菌羊乳饮料的感官评分呈现先上升后下降的趋势，当果糖添加量为10%时，感官评分最高，当果糖添加量超过10%时，产品口感偏甜，焦糖风味浓郁，掩盖了产品原有的奶香味，感官评分下降。同时当果糖添加量为10%时，黄蓝值最大，美拉德反应程度最大，但是果糖添加量超过10%时，黄蓝值下降，可能由于果糖浓度的增大，果糖分子之间的碰撞几率增大，引起焦糖化反应程度增加，进而使美拉德反应程度下降，导致黄蓝值减小，因此选择果糖添加量为10%为最佳果糖添加量。

2.1.3 褐变温度的确定

美拉德反应受温度的影响很大，温度相差10℃，褐变速度相差3～5倍[27]。由图3可知，在选定的温度范围内，褐色益生菌羊乳饮料的感官评分先上升后下降的趋势，当温度为95℃时，感官评分最高，呈现棕褐色，焦香风味明显，温度低于92℃，美拉德反应程度较低，产物特征香味不明显；当温度高于95℃时，感官评分下降，可能是因为美拉德反应程度较大，类黑精物质生成较多，掩盖了原有的风味[28-29]。同时，随着温度的升高，产品的黄蓝值增大，美拉德反应程度增大。考虑经济成本和节约能源，因此选择95℃为美拉德反应温度。

2.1.4 褐变时间的确定

反应时间是影响美拉德反应的重要因素之一，通常反应时间与美拉德反应程度成正比。由表4可知，随着时间的延长，褐色益生菌羊乳饮料的感官评分呈现上升后平稳的趋势，当褐变时间为150 min时，焦香风味充足，但在褐变时间180 min时，产品伴有淡淡的苦香味。同时，产品的黄蓝值随着褐变时间的延长而增大，即美拉德反应程度逐渐增大，当褐变时间超过150 min时，产品基本呈现褐色。考虑到经济成本和节约能源，因此选择150 min为最佳褐变时间。

图1 不同还原糖对褐色益生菌羊乳饮料品质的影响

图2 果糖添加量对褐色益生菌羊乳饮料品质的影响

图3 褐变温度对褐色益生菌羊乳饮料品质的影响

图4 褐变时间对褐色益生菌羊乳饮料品质的影响

2.2 响应面法优化美拉德反应条件

2.2.1 响应面试验设计与结果

根据单因素试验结果及Box-Behnken中心组合设计原理，以果糖添加量（A）、褐变温度（B）、褐变时间（C）作为3因素，以黄蓝值和感官评分为响应值，进行响应面优化试验。试验设计方案及数据结果如表2所示，对表2中数据进行方差分析，结果如表3和表4。

利用Design-Expert软件对表3试验数据进行多元回归方程拟合，建立以黄蓝值对果糖添加量（A）、褐变温度（B）、褐变时间（C）的拟合方程为Y1=11.11+0.26A+1.37B+1.28C+0.015AB+-0.15BC-0.58A2+0.91B2+0.37C2。

由表4可知，当模型F=311.00时，P＜0.0001，说明模型是极显著的。当失拟项F=2.20时，P=0.2311＞0.05，说明模型失拟项不显著。决定系数R2=0.9975，校正系数R2Adj=0.9943，表明黄蓝值的实测值与预测值之间具有较好的拟合度，表明该模型能够很好的对褐色益生菌羊乳饮料的黄蓝值进行分析和预测。

通过方差分析，该模型中的一次项A、B、C与二次项A2、B2、C2表现为极显著，交互项BC表现为显著，交互项AB、AC对黄蓝值影响不显著，表明实验中褐变温度、褐变时间都对褐色益生菌羊乳饮料的黄蓝值具有较大影响。由3个因素F值大小可以推断影响褐色益生菌羊乳饮料品质的各因素主次顺序为：B＞C＞A，即褐变温度＞褐变时间＞果糖添加量。

利用Design-Expert软件对表3试验数据进行多元回归方程拟合，建立以感官评分对果糖添加量（A）、褐变温度（B）、褐变时间（C）的拟合方程为Y1=77.60+0.75A+4.00B+3.25C+0.25AB+0.25AC+0.25BC-1.43A2+3.07B2-0.92C2。

表3 响应面试验设计及结果

表4 黄蓝值方差分析表

由表5可知，当模型F=36.47时，P＜0.0001，说明模型是极显著的。当失拟项F=1.04时，P=0.4649＞0.05，说明模型失拟项不显著。决定系数R2=0.9791，校正系数R2Adj=0.9943，表明感官评分的实测值与预测值之间具有较好的拟合度，表明该模型能够很好的对褐色益生菌羊乳饮料的感官评分进行分析和预测。

通过方差分析，该模型中的一次项B、C与二次项B2对感官评分影响极显著，二次项A2、C2对感官评分影响显著，交互项AB、AC、BC对感官评分影响不显著，表明实验中褐变温度、褐变时间都对褐色益生菌羊乳饮料的感官评分具有较大影响。由3个因素F值大小可以推断影响褐色益生菌羊乳饮料品质的各因素主次顺序为：B＞C＞A，即褐变温度＞褐变时间＞果糖添加量。

表5 感官评分方差分析表

2.2.2 响应面分析

为了考察各个交互项对褐色益生菌羊乳饮料黄蓝值、感官评分的影响，利用Design-Expert软件对回归方程进行运算，作出交互项的三维响应面图及等高线图如图5、图6所示，能比较直观的解释各个变量和变量之间的对响应值的影响。通过Design-Expert对建立的回归方程进行参数优化分析，可得到黄蓝值最高，感官评分最高时最佳褐变工艺条件，即果糖添加量11.35%、褐变温度97℃、褐变时间180 min。在此条件下褐色益生菌羊乳饮料的黄蓝值为14.3345，感官评分为86.352。

2.2.3 验证试验

利用Design-Expert软件进行回归模型预测褐色益生菌羊乳饮料的最佳褐变工艺方案为果糖添加量11.35%、褐变温度97℃、褐变时间180 min。为了检验该回归模型预测的可靠性，同时考虑到实际生产操作，将最佳褐变工艺方案更改为果糖添加量11%、褐变温度97℃、褐变时间180 min。在该条件下重复三次试验，得到产品的平均黄蓝值为14.12，平均感官评分为86.7，黄蓝值的相对误差为1.49%，感官评分的相对误差为0.40%，与预测值基本一致，说明该模型拟合度较好，能够较好的预测实际情况。

3 结论

在单因素试验的基础上，通过响应面法建立了多元回归模型，确定了褐色益生菌羊乳饮料的最佳褐变工艺条件，即确定的最佳褐变工艺条件为：果糖添加量11%、褐变温度97℃、褐变时间180 min。在此条件下的验证试验中褐色益生菌羊乳饮料的平均黄蓝值为14.12，平均感官评分为86.7，与预测值基本一致，此时美拉德反应状态良好，使褐色益生菌羊乳饮料色泽呈现黄褐色，焦糖风味突出，口感细腻清爽，符合对生产饮料的要求，可以应用到中试生产中。

图5 各因素交互作用对黄蓝值的响应面和等高线图

图6 各因素交互作用对感官评分的响应面和等高线图