HPLC法测定特殊医学用途婴配食品中的α-生育酚醋酸酯和α-生育酚的研究

李涛，周艳华，孙桂芳，杨滔，杨庆懿

(1.湖南省食品质量监督检验研究院长沙 410111；2.长沙环境保护职业技术学院长沙 410004）

0 引 言

特殊医学用途婴儿配方食品（以下简称特医婴配食品）是部分患病婴儿生命早期或出生后相当长时间内赖以生存的唯一或主要食物来源，《食品安全国家标准特殊医学用途婴儿配方食品通则》对各项营养指标进行规定[1-2]。维生素E又名生育酚，具有多种异构体，具有消除体内自由基、促进血液循环等多种生理功能，自然界分布最广泛和含量最高的是α-生育酚[3]。α-生育酚醋酸酯是由α-生育酚的酚羟基乙酰化得到，不易受空气、光、紫外线的作用氧化，具有更好的稳定性和药理功效[4]。维生素E是特医婴配食品中一项重要的营养指标，对于婴儿尤其是新生儿、早产儿的生长发育过程有着重要的影响，添加形式为α-生育酚及α-生育酚醋酸酯[5-7]。目前，现有维生素E测定主要有液相法和液相色谱串联质谱法，现有食品安全国家标准中维生素E测定是一般需对样品进行酶解、皂化、提取、分离、浓缩等步骤，操作极其繁琐耗时[8-10]。特医婴配食品中维生素E的检测未见报道，特医婴配食品有6种配方，经研究发现依照现有标准中皂化条件进行皂化，会出现皂化不完全、严重乳化、维生素E结果偏低等现象，且α-生育酚不稳定，在此分析过程中易损耗，回收率不高，不能进行批量操作。此试验采用正向高效液相色谱直接测定特殊医学用途配方食品中的α-生育酚和α-生育酚醋酸酯[11]。此检验方法能准确测定产品中α-生育酚营养强化类别及含量，指导特医生产企业对产品的质量控制，也为特医婴配食品中维生素E检测提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

特医无乳糖配方奶粉（A）、特医乳蛋白部分水解配方奶粉（B）、特医乳蛋白深度水解配方奶粉（C1）/氨基酸配方奶粉（C2）、特医早产/低出生体重婴儿配方乳(D)、特医母乳营养补充剂（E）、特医氨基酸代谢障碍配方乳（F）来源于雅培等企业。

标准品：纯度96.0%DL-α-生育酚（上海安谱）；纯度98.4%DL-α-生育酚醋酸酯，（Dr.E）；异丙醇、叔丁基甲醚、正己烷、甲醇、无水乙醇、异辛烷、均为色谱纯（上海安谱）；对苯二酚、冰醋酸、无水乙酸钠、盐酸，均为分析纯（上海安谱）；木瓜蛋白酶＞400 U/mg，（BoMei0696）。

1.1.2 主要仪器设备

LC-20A高效液相色谱仪(带DAD检测器，日本岛津公司)，HMS-350漩涡振荡器（上海珂淮仪器有限公司），BS224S电子分析天平（德国赛多利斯公司），X 1R台式冷冻离心机（赛默飞世尔科技（中国）有限公司），PB-10 pH酸度计（德国赛多利斯公司），HWS-28电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的制备

分别称取α-生育酚醋酸酯和α-生育酚约25 mg（准确至0.1 mg)至25 mL容量瓶中，异辛烷溶解并定容至刻度。分别精取1.0 mL标准溶液至10 mL容量瓶中，异辛烷稀释至刻度，得100.0μg/mL混标储备液，分别精取0.05、0.10、0.20、0.50、1.0、2.0、4.0 mL混标储备液至10 mL容量瓶中，异辛烷稀释至刻度，得浓度为0.5～40.0μg/mL的标准使用液。

1.2.2 供试品溶液的制备

（1）样品称量固体样品混匀后精确称重0.5 g至50 mL离心管；液态样品精确称取5.0 g至50 mL离心管中。

（2）酶解800 U/mL木瓜蛋白酶溶液：称取250 mg对苯二酚和10.0 g无水醋酸钠于250 mL容量瓶中，加水200 mL溶解，用盐酸溶液调节pH至5.0，加入0.5 g木瓜蛋白酶超声5 min，冷却后定容至刻度。向样品溶液中加入5.0 mL木瓜蛋白酶溶液，混匀后置于37±2℃水浴30 min后冷却。

（3）提取向酶解液中加入20.0 mL 2%醋酸甲醇，振荡15 min，精密加入10.0 mL异辛烷振荡提取15 min，5 000 r/min离心机中离心10 min，取异辛烷层用于高效液相色谱分析。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax NH2（4.6 mm×150 mm×5 μm）；流动相A为正己烷，流动相B为25%叔丁基甲醚正己烷，流动相梯度洗脱程序详见表1；柱温：30℃；流速：1.0 mL/min；进样量：50μL；荧光检测器的激发波长为280 nm，发射波长为310 nm。

表1 梯度洗脱程序

2 结果与分析

2.1 线性关系考察

取标准使用液注入液相色谱仪测定，以峰面积（Y）为纵坐标，进样浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，见图1和图2。α-生育酚醋酸酯线性方程为：Y=266 153.35X+2 760.08(R2=0.999 9)，α-生育酚线性方程为 Y=1 552 209.8X-89 555.89(R2=0.999 5)，标准工作液浓度在0.5～40.0μg/mL范围内，校准曲线线性良好。

图1 α-生育酚醋酸酯标准曲线图

图2 α-生育酚标准曲线图

2.2 检出限和定量限

取空白响应值的2～3倍对应浓度的混合标准溶液0.5μg/mL，平行测定11次，根据检出限的计算方法LOD=3sd/b和LOQ=10sd/b(sd为标准偏差，b为工作曲线斜率)，当取样量为0.5 g，异辛烷提取体积为10.0 mL时，方法检出限和定量限见表2。此方法的检出限与定量限低于GB 5009.82-2016，说明此检验方法具有更高的灵敏度。

2.3 样品含量测定和精密度试验

特医婴配食品A-F分别平行取样6组，按供试品溶液制备方法制备，进液相色谱测定，特医婴配食品A-F号中α-生育酚醋酸酯和α-生育酚含量及精密度结果见表3和表4。结果显示6种特医婴配食品配方中均添加α生育酚醋酸酯和α-生育酚，且添加量依据适用对象的差异而不同，母乳营养补充剂中α-生育酚醋酸酯含量最高，氨基酸配方中α-生育酚含量最高；各配方中α-生育酚醋酸酯含量为0.37～69.0 mg/100g，精密度为0.6%～9.9%，α-生育酚含量为0.16～8.4 mg/100g，精密度在1.3%～7.2%之间，精密度均满足测定要求。

表2 检出限和定量限

表3 特医婴配食品中α-生育酚醋酸酯含量及精密度

表4 特医婴配食品中α生育酚含量及精密度

2.4 加标回收率试验

选取深度水解配方奶粉（C1）为代表进行特医婴配食品回收率试验，共9份，每个浓度3份，分别添加12.0μg、24.0μg、40.0μg的混合标准溶液，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进液相色谱测定。α-生育酚醋酸酯和α-生育酚加标回收率见表5。由表5可知，α-生育酚醋酸酯在不同添加浓度下回收率在80.2%～91.1%之间，RSD值为0.7%～5.4%，α-生育酚在不同添加浓度下回收率在80.4%～94.8%之间，RSD值为1.8%～5.8%之间，深度水解配方奶粉为特医婴配奶粉中最复杂基质之一，说明该方法对特医婴配食品中不同浓度α-生育酚醋酸酯和α-生育酚的测定具有较高的准确度。

表5 样品加标回收率

2.5 检验方法的选择性

图3和图4分别为混合标准溶液和7种特医婴配食品中α-生育酚醋酸酯和α-生育酚的图谱，α-生育酚醋酸酯保留时间为4.7 min，α-生育酚保留时间为12.1 min，样品长时间测定过程中α-生育酚醋酸酯保留时间会发生一定变化，因此测定过程中需添加标准溶液进行定性。特医婴配食品成分及其复杂，但应用荧光检测器进行检测，由图4可知，未发现基质干扰，表明该检验方法对特医婴配食品中中α-生育酚醋酸酯和α-生育酚具有良好选择性，分离度高。

图3 标准溶液中α-生育酚醋酸酯和α-生育酚

3 结论

试验建立正相液相色谱测定特医婴配食品中的α-生育酚醋酸酯和α-生育酚的测定方法。采用木瓜蛋白酶酶解蛋白质，游离包裹的α-生育酚醋酸酯和α-生育酚，酸化甲醇沉淀蛋白质类物质，异辛烷提取，氨基柱正相分离，荧光检测。在0.5～40.0μg/mL范围内呈线性相关，α-生育酚醋酸酯和α-生育酚检出限分别为5.6μg/100g和6.9μg/100g，不同添加浓度回收率为80.2%～94.8%。

图4 特医婴配食品中α-生育酚醋酸酯和α-生育酚

维生素E活性用α-生育酚当量（α-TE）表示，1 mgα-TE=1 mg d-α-生育酚，用此检验方法检验特医婴配食品中维生素E（α-TE）含量时需折算，1 mg dl-α-生育酚=0.74 mg d-α-生育酚，1 mg dl-α-生育酚醋酸酯=0.67 mg d-α-生育酚，此检验方法的线性范围和检出限均优于现有食品安全国家标准GB 5009.82-2016。前期试验研究表明现有国标测定特医婴配食品中α-生育酚时，多种配方产品皂化时会出现乳化现象严重、皂化不完全和精密差等问题。本试验方法采用直接测定样品中α-生育酚醋酸酯和α-生育酚，避开操作繁杂的皂化过程，操作简单，精密度和准确度高，可实现批量检测。此试验建立的检测方法简单、快速、准确，针对特医婴配产品中的α-生育酚醋酸酯和α-生育酚检测重复性好，为特殊医学用途食品生产厂家进行质量控制提供指导，也为检测特医婴配食品中维生素E提供技术参考。