NEK2在胃癌中的表达及其与化疗药物敏感性之间的关系

王素芳 郑绘霞 梁建芳 肖虹

中心体的主要生理学作用是参与细胞的有丝分裂，是细胞中最为重要的微管系统[1]，中心体及相关作用原件的异常调控可导致细胞增殖、分化、有丝分裂等作用失常[2]。NEK2（NIMA related kinases 2）是一种丝/苏氨酸蛋白激酶NIMA相关激酶，属于中心体蛋白相关激酶NEK家族成员之一[3]，主要在有丝分裂周期过程的G2/M期发挥作用[4]。据报道，NEK2表达上调可推进有丝分裂进程、触发染色质分裂，在肿瘤的发生及进展过程中起关键作用[5]。此外，NEK2的异常表达可能通过ABC蛋白转运系统、AKT信号通路等参与细胞耐药过程[6]。本研究观察了胃癌组织中NEK2蛋白的表达情况及其与胃癌的基础化疗药5-氟尿嘧啶（5-FU）、顺铂药物敏感性之间的关系，现将实验结果整理报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年8月-2017年3月期间山西医科大学第一医院手术切除的胃癌及癌旁新鲜组织患者60例（癌旁组织要求距肿瘤组织＞5 cm）作为研究对象，纳入标准：初发、散发，均无胃癌家族史；术前均未经任何放、化疗；术后经病理诊断证实均为胃腺癌。排除标准：围手术期经过放、化疗或靶向治疗；标本的留取可能会影响病理诊断。其中男39例，女21例；年龄38～68岁，平均（52.3±10.5）岁；高分化9例，中分化35例，低分化16例；有淋巴结转移21例，无淋巴结转移39例；美国癌症联合委员会AJCC胃癌TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期34例，Ⅲ+Ⅳ期26例。所有患者均知晓本次研究并签署知情同意书，该研究已经本院伦理委员会伦理审查通过。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组织化学实验 组织浸泡于中性福尔马林液中充分固定，常规石蜡包埋，4 μm切片，烤片，EDTA高压热修复。NEK2一抗（美国thermo fisher）浓度为1∶200，操作步骤按试剂盒说明书进行。DAB显色，苏木精复染。以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。判定方法：选取5个具有代表意义的高倍视野，计数100个细胞[7]。NEK2阳性信号定位于细胞质和/或细胞核，评分以染色强度和阳性细胞百分比的乘积表示。染色强度：无着色0分，浅黄色为1分，棕黄色和棕褐色2分。阳性细胞数：＜10%为0分，10%～50%为1分，＞50%为2分。乘积＜2分为阴性，≥2分为阳性。由两名病理医师共同评分。

1.2.2 蛋白印迹实验 提取新鲜组织蛋白，BCA试剂盒（上海碧云天）检测蛋白浓度，按说明书步骤进行。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白转膜至硝酸纤维素膜（武汉博士德），NEK2一抗（浓度1∶200），GAPDH 一抗（1∶300）4 ℃过夜反应，室温下二抗反应1 h，ECL电化学发光液（北京索来宝）显色，凝胶成像仪下曝光显色，目的蛋白的相对表达量以其与GAPDH的灰度值之比表示。

1.2.3 体外药敏实验 电子天平称取1 g肿瘤新鲜组织，青链霉素双抗液反复冲洗组织，置于离心管内充分剪碎，碾磨呈糊状，加入消化酶，37 ℃孵箱内放置1 h，将组织液缓慢通过200目不锈钢滤网，收集滤液，1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基（美国thermo fisher）。细胞计数板计数调整细胞浓度至1×105/mL，接种于96孔板中，37 ℃，5% CO2孵箱中培养，24 h后更换含药物的培养基，其中5-FU（生产厂家：西安海欣药业，国药准字：H20031272）35.0 μg/mL，顺铂（生产厂家：山东齐鲁制药，国药准字：H20023460）4.6 μg/mL，继续培养24 h，加入5%浓度的MTT（美国sigma）20 μL，孵育4 h后弃去上清液，加入二甲基亚砜（上海生工）150 μL，水平摇床轻摇3 min，设定酶标仪波长490 nm，检测光密度值A。按照公式：1-试验孔A均值/对照孔A均值×100%计算抑制率IR，IR≥30%定为敏感，IR＜30% 定为耐药[8]。

1.3 观察指标 观察NEK2在胃癌、癌旁组织及转移性淋巴结组织中的表达情况；NEK2在胃癌组织中的表达与临床、病理学因素之间的关系；胃癌新鲜组织对5-FU、顺铂药物的敏感性；NEK2的表达与5-FU、顺铂敏感性之间的关系。

1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（±s）表示，两两比较采用t检验，组间比较采用配对t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NEK2在胃癌及癌旁组织中的表达情况分析 NEK2在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1，图1A、B。黏膜内癌显示较为明显的对比：肿瘤细胞呈阳性表达，相邻的正常固有腺呈阴性表达，见图1C。转移性淋巴结组织中肿瘤细胞呈阳性表达，见图1D。

表1 NEK2在胃癌及癌旁组织中的表达情况分析 例

图1 NEK2在胃癌、癌旁及转移性淋巴结组织中的表达（IHC×200）注：A癌旁组织中的NEK2阴性表达；B腺癌组织中的NEK2阳性表达；C黏膜内癌中的NEK2阳性表达，左侧为癌组织，右侧为正常固有腺；D转移性淋巴结组织中的NEK2阳性表达。

2.2 NEK2在胃癌组织中的表达与临床、病理学因素之间的关系分析 NEK2在胃癌组织中的表达与患者的年龄、性别、肿物大小比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；与分化程度、TNM分期和淋巴结转移比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 NEK2在胃癌组织中的表达与临床、病理学因素间的关系 例

2.3 NEK2蛋白相对表达量与5-FU、顺铂敏感性之间的关系 60例胃癌新鲜组织中去除污染、贴壁不佳及实验操作等，最终35例原代培养成功。其中，5-FU耐药22例，耐药率为62.9%；顺铂耐药19例，耐药率为54.3%。5-FU敏感组及耐药组NEK2蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；顺铂敏感组及耐药组NEK2蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。NEK2蛋白相对表达量与5-FU的药物敏感性无显著关系（P＞0.05），而顺铂耐药组NEK2蛋白表达量显著增高（P＜0.05），见图 2。

表3 5-FU、顺铂敏感组及耐药组NEK2蛋白的相对表达量比较（±s）

表3 5-FU、顺铂敏感组及耐药组NEK2蛋白的相对表达量比较（±s）

类别 敏感组 耐药组 t值 P值5-FU（n=35） 0.942 0±0.168 8 1.040 4±0.288 9 -0.657 0.529顺铂（n=35） 0.661 0±0.100 5 1.117 0±0.300 4 -3.153 0.014

图2 NEK2在5-FU及顺铂敏感/耐药组中的表达注：1、2、3泳道为5-FU敏感组，4、5、6泳道为5-FU耐药组；a、b、c为顺铂敏感组，d、e、f泳道为顺铂耐药组。

3 讨论

NEK2是1992年Letwin等[9]学者从小鼠细胞中鉴定出的一种蛋白激酶，人类NEK2基因编码的蛋白质含有445个氨基酸残基，分子量大小为48 KD，激酶区域有典型丝/苏氨酸蛋白激酶的氨基酸序列，在纺锤体组装监控点、中心体分裂、染色体不稳定中发挥重要的作用[10-11]。NEK2在肿瘤中的作用是近年来国内外学者关注的重点，现有的报道表明，NEK2在胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌等上皮源性肿瘤[12-14]，以及霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤、精原细胞瘤等间叶源性肿瘤中均存在不同程度的表达上调[15-17]，功能学研究证实：下调肿瘤细胞中NEK2的基因表达，可使肿瘤细胞增殖活性降低、周期受阻、凋亡增加，有望成为肿瘤靶向治疗的候选基因。本研究结果表明，与癌旁正常组织相比，NEK2在胃癌组织中的表达显著上调，提示胃癌组织中中心体蛋白相关激酶通路可能出于失调控状态，NEK2可能参与了胃癌的发生过程。在胃癌组织中，NEK2的表达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移以及TNM分期有关，说明NEK2可能与胃癌的恶性程度及预后有关。

肿瘤细胞产生耐药性是常规化疗药物及靶向药物在临床应用时治疗终止或失败的主要原因，据报道：当NEK2基因表达上调时，肿瘤细胞将化疗药物由细胞内泵出细胞外的活性增加，NEK2活性增加可导致ABC蛋白转运家族各成员表达上调[18]，抑制AKT信号转导途径中PP1的活性[19]，从而导致肿瘤细胞耐药。对乳腺癌细胞耐药机制的研究中发现：NEK2干扰siRNA可以增加癌细胞对化疗药物的敏感性[20]。沉默NEK2基因的表达可以提高肺癌耐药细胞株对阿霉素、顺铂等药物的敏感性，NEK2有望成为逆转肿瘤细胞耐药的一个新的基因靶点[21]。本研究采用体外药敏实验，检测了胃癌细胞对常规化疗药物5-FU及顺铂的敏感性，结果表明5-FU耐药率为62.9%，顺铂耐药率为54.3%，按照癌细胞对不同化疗药体外的抑制率，笔者将其分为敏感和耐药两组，NEK2与5-FU的药物敏感性无显著关系，而顺铂耐药组NEK2蛋白的表达量显著增高，说明胃癌中NEK2的表达可能与铂类药物的耐药性有关。

综上所述，NEK2在胃癌组织中表达上调，与肿瘤的进展程度及顺铂耐药有关，有望成为胃癌诊断、预后及治疗新的分子靶点，由于中心体相关蛋白激酶及其调控网络庞大且复杂，NEK2在肿瘤中的具体作用机制尚待进一步研究。