CecropinXJ抑制肝癌BEL-7402细胞增殖及机制研究*

施嫣嫣 沈夕坤 袁 琴 陶婷婷

（江苏省苏州市中医医院，南京中医药大学苏州附属医院，江苏 苏州 215000）

肝癌是一种严重威胁人类健康和生命的恶性肿瘤，发病率逐年上升［1］。目前针对肝癌的治疗方法主要包括手术、放疗、化疗等，但是手术切除适用范围小且易复发，放化疗手段常伴有骨髓抑制及肝、肾、胃肠道等严重不良反应［2-3］。因此，开发出高效、低毒的新型抗肿瘤药物显得尤为重要。

近年来，传统中药以其高效、低毒和多靶点的优势，在改善患者临床症状、防止复发、抑制瘤体的生长、延长生存期等方面发挥了独特的作用，成为肿瘤综合治疗手段中必不可少的组成部分［4-5］。自上个世纪70年代末于昆虫体内发现抗菌肽 （Antimicrobial peptides）以来，仅昆虫类的抗菌肽迄今已发现100多种，抗菌肽

具有广谱抗菌作用，随着研究的深入，人们发现其中一部分抗菌肽还具有明显的抗肿瘤活性［6-7］。新疆家蚕抗菌肽CecropinXJ属于天蚕素-B类家族，具有很强的热稳定性，抗菌谱广，有报道证实Cecropins家族的抗菌肽可以有效地杀伤肿瘤细胞［8-9］。本文通过体内外方式验证CecropinXJ抑制肝癌细胞生长的功能并探讨其机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物与细胞 SPF级裸鼠20只，雄性，体质量18~20 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）2015-0005。BEL-7402和 LO2细胞由中国科学院上海生科院细胞资源中心提供。

1.2 药物与试剂 RPMI-1640，Gibco公司；胎牛血清，Gibco公司；胰蛋白酶，Gibco公司；青霉素、链霉素，Sigma公司；ECL化学发光试剂，Thermo公司；Bax（D2E11） Rabbit mAb，Bcl-2 （124） Mouse mAb，Cleaved Caspase-3 （Asp175） （5A1E） Rabbit mAb，Caspase-3 Antibody，β-Actin （13E5） Rabbit mAb，Anti-mouse IgG，HRP-linked Antibody，Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody，均来自 Cell Signaling Technology；CexropinXJ由上海吉尔生化公司合成，用RPMI-1640配置成质量浓度为1 mg/mL，通过0.22 μm滤膜过滤备用。

1.3 BEL-7402细胞存活率试验 取对数生长期BEL-7402细胞，调整细胞浓度为5×104个/mL，将其均匀铺至96孔板中，置于细胞培养箱培养约24 h，吸弃孔中上清液，用PBS洗1~2遍，加入不含血清的培养基稀释得到的一系列浓度CecropinXJ药液，每个浓度设置6个复孔。置于培养箱中孵育48 h后，弃上清，用PBS洗2遍，接下来向每孔中加入10 μL CCK-8试剂和90 mL无血清培养基，培养30 min，用酶标仪测定各孔在450 nm处的OD值，实验中同时设立正常细胞对照组和空白对照组。

1.4 造模与分组 将BEL-7402细胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中培养，当细胞生长至约85%时，收集对数生长期细胞，调整密度为1×107个/mL。将裸小鼠腋下皮肤消毒后在右腋下接种约0.2 mL肿瘤细胞悬液，每天观察裸鼠，接种1周后，待瘤体生长到50 mm3，视为造模成功。将20只成模小鼠随机分为模型组和CecropinXJ组，每组10只。模型组予生理盐水 0.2 mL；CecropinXJ组予 CexropinXJ（0.1 mL，100 μg）；每日腹腔注射1次，连续给药15 d，给药期间所有裸鼠正常饮食。

1.5 标本采集与检测 1）抑瘤率测量。最后1次给药结束后次日，脱颈处死小鼠，迅速剥离完整的肿瘤组织，称瘤质量，计算各药物组的肿瘤生长抑制率：抑瘤率=（模型组平均瘤质量-实验组平均瘤质量）÷模型组平均瘤质量×100%。2）小鼠血液及肝肾功能影响的检测。末次给药后24 h，对裸鼠称重，每只腹腔注射0.5%肝素0.5 mL，使肝素化后摘除眼球取血，肝素抗凝全血检测血两组小鼠血红蛋白（Hb）、白细胞（WBC）和红细胞浓度（RBC）。3）凋亡蛋白表达的检测。取一定量小鼠肿瘤组织，加入含有10%PMSF的RIPA裂解液，充分研磨后高速冷冻离心，吸取上清后分装至1.5 mL离心管；用BCA法测定蛋白含量，分装，保存至-20℃；取部分样品，用裂解液调整蛋白浓度至10 mg/mL，按4∶1比例加入5×上样缓冲液混合，沸水浴5 min，充分变性蛋白，分装保存至-80℃冰箱备用。进行SDSPAGE电泳，转膜后加入5%脱脂奶粉（PBST溶解）封闭2 h；加入一抗孵育，将PVDF膜放入含有抗体的PBST缓冲液中，4℃过夜。一抗回收后，PBST洗3次，分别加入HRP-Goat anti-rabbit和HRP-Goat antimouse的二抗孵育（二抗稀释比例为1∶1000），将PVDF膜放入含有二抗的PBST缓冲液中，室温轻摇孵育杂交2 h。二抗回收后，PBST洗3次，每次10 min。PBST倒掉后，加入ECL发光液，在暗盒中反应2～3 min，将PVDF膜用塑料薄膜包好，置于凝胶成像系统拍照。经Image Pro Plus软件处理图像中蛋白条带，以光密度进行量化分析。

1.6 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用t检验比较两组间差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CecropinXJ对细胞增殖的影响 见图1，表1。结果显示CecropinXJ多个剂量组均可抑制BEL-7402细胞的增殖，而且呈药物浓度依赖性，对人正常肝细胞（LO2细胞）无抑制作用。

图1 CecropinXJ对细胞增殖的影响

表1 CecropinXJ对细胞增殖的影响（±s）

表1 CecropinXJ对细胞增殖的影响（±s）

与模型组比较，**P＜0.01。下同

组别 BEL-7402 LO2模型组 101.24±5.04 102.68±4.31 Cecropin XJ 6.25 μg/mL 组 82.35±1.02** 104.35±2.64 Cecropin XJ 12.5 μg/mL 组 76.36±1.23** 103.82±2.02 Cecropin XJ 25 μg/mL 组 70.01±2.63** 106.32±1.56 Cecropin XJ 50 μg/mL 组 52.75±1.03** 101.78±1.06 Cecropin XJ 100 μg/mL 组 50.30±1.23** 108.46±1.38

2.2 CecropinXJ对BEL-7402移植瘤生长的影响 见表2。整个实验过程中，小鼠的饮食、活动和生长情况等均良好，模型组小鼠移植瘤生长较快，与模型组比较，CecropinXJ显著抑制移植瘤的生长，抑瘤率为36.7%。

表2 CecropinXJ对BEL-7402荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

2.3 CecropinXJ对小鼠血液系统的影响 见表3。在连续给药15 d后，检测发现CecropinXJ组小鼠的血红蛋白、白细胞和红细胞与模型组相比差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表3 CecropinXJ对BEL-7402荷瘤小鼠血液的影响（±s）

表3 CecropinXJ对BEL-7402荷瘤小鼠血液的影响（±s）

组 别 WBC（×109/L） RBC（×109/L）模型组 8.50±0.54 7.01±0.61 CecropinXJ组 8.32±0.51 7.13±0.58 n Hb（g/dl）10 13.30±0.85 10 12.89±0.81

2.4 CecropinXJ对凋亡相关蛋白的影响 见图2，表4。Western Blotting结果显示与模型组比较，Cecropin-XJ可以显著上调Bax/Bcl-2的比值（P＜0.01），并显著上调 Cleaved-Casp3的表达（P＜0.01）。

图2 CecropinXJ对凋亡相关蛋白表达的影响

表4 CecropinXJ对凋亡相关蛋白表达的影响（±s）

表4 CecropinXJ对凋亡相关蛋白表达的影响（±s）

?

3 讨 论

随着中医药治疗肿瘤研究的深入，其在延长生存时间、改善生存质量等方面的疗效已获得肯定［10-11］。昆虫类中药材的应用在我国有着悠久的历史，如斑蝥、水蛭、蜈蚣、蝎子和土鳖虫等都以各种形式被广泛用于治疗肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、食道癌和结肠癌等各种肿瘤的治疗［12-13］。作为其主要物质基础的抗菌肽以高效、低毒和在耐药性方面的优势，使其在抗肿瘤方面有良好的应用前景。

本研究发现新疆家蚕抗菌肽CeceopinXJ能够在体外显著抑制肝癌细胞生长并呈现剂量依赖性，对正常肝细胞无明显影响；通过体内实验发现，CeceopinXJ在体内抑制肝癌移植瘤的生长，抑瘤率为36.7%；该组小鼠未见有消瘦和厌食等异常，血液检测结果和模型组比较也无显著差异。

细胞凋亡是一种细胞主动性死亡模式，在肿瘤的形成和发展过程中扮演着重要的角色。细胞凋亡主要有3种途径，线粒体依赖的细胞凋亡途径发挥着重要的作用，其中Bcl-2家族蛋白占有相当重要的地位，其中一类能抑制细胞凋亡，如Bcl-2和Bcl-xl等，而另外一些蛋白如Bax和Bad可以促进细胞凋亡，提高Bax与Bcl-2的比值对细胞凋亡的发生具有决定性作用［14-15］。

Caspases是一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，能够高度选择性地切割某些蛋白质，进而活化相关蛋白。具体参与细胞凋亡执行的是Caspase-3，Caspase-6 和 Caspase-7，其中 Caspase 3 和Caspase 7具有相近的底物和抑制剂特异性，它们降解PARP，导致DNA修复的抑制并启动DNA的降解［16-17］。本研究证明CecropinXJ可以显著抑制上调Bax/Bcl-2的比值，增强Cleaved-Casp3和cleaved-PARP的表达。

综上所述，CecropinXJ可以显著抑制肝癌BEL-7402细胞和体内移植瘤的生长，同时对正常肝细胞和血液系统无毒副作用，其机制与诱导细胞凋亡相关。