心痛泰抑制动脉粥样硬化兔炎症反应的作用机理研究*

张建影 李 雅 郭志华 易 琼 任 欣 刘 梨

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙410208）

动脉粥样硬化是一种由动脉壁脂质潴留，血管内皮损伤引起的慢性炎症性疾病，是导致心脑血管疾病发生的重要因素［1-2］。动脉粥样硬化具有经典炎症变性、渗出和增生的特点，炎症反应是动脉粥样硬化致病的共同环节或通路，其可通过激活单核细胞产生促炎症因子，从而诱导血管平滑肌细胞发生迁移和增殖，导致内皮细胞损伤和炎症细胞激活，是动脉粥样硬化形成的主要原因。抗炎、保护血管内皮治疗对防治动脉粥样硬化具有重要作用［3-4］。心痛泰可有效治疗动脉粥样硬化，前期研究表明：其可通过降低动脉粥样硬化家兔的核因子-κB（NF-κB）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、血清脂蛋白相关磷脂酶 A2（Lp-PLA2）、白细胞介素6（IL-6）、主动脉高敏C反应蛋白 （hs-CRP）、血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1（LOX-1）的表达，提高抗炎因子白细胞介素-10（IL-10）的表达，抑制动脉粥样硬化的炎症反应［5-6］。本文在前期研究基础上，以动脉粥样硬化兔为实验对象，通过测定Toll样受体4（TLR4）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、髓过氧化物酶 （MPO）、Ras基因家族成员A（RhoA）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表达，进一步研究心痛泰能否通过Toll样受体、MAPK以及Ras基因家族等信号通路调控机体炎症反应，为中药新药研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

120 只雄性日本大耳白兔，清洁级，10~12周龄，体质量（2.19±0.135）kg，购自湖南中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（湘）2009-0012。动物购进后，单笼饲养，适应性喂养1周。

1.2 药物及饲料

心痛泰由丹参、川芎、三七、郁金、木香、山楂、枳壳、葛根组成，中药饮片购自湖南中医药大学第一附属医院中药房，经本院药剂科鉴定所有药材均符合药典标准。取2倍量处方药材，温水浸泡1 h，水量超出药物5~6 cm，大火煮沸后转小火煎30 min，趁热过滤，药渣按前法再煎煮两次，将3次药液混匀、过滤，减压浓缩至每克药粉相当于15 g生药。瑞舒伐他汀钙片，规格：10 mg/片，购自阿斯利康制药有限公司。高脂饲料由77.5%基础饲料、15%蛋黄粉、5%猪油、2%胆固醇、0.5%胆酸钠组成，由湖南中医药大学动物实验中心加工而成。

1.3 试剂及仪器

p-p38 抗体 （Bioss，Bs-0636R），MPO 抗体（Bioss，Bs-4943R），RhoA 抗体 （Bioss，Bs-1180R），TLR4 抗体（BOSTER，BA1717），eNOS 抗 体 （Abcam，Ab66127），GAPDH 抗体（CST，#5174），羊抗兔 HRP 标记二抗（碧云天生物技术研究所，A0208），羊抗鼠HRP标记二抗（碧云天生物技术研究所，A0216）；Trizol（invitrogen 公司产品），DEPC处理水 （上海基尔顿生物科技有限公司），氯仿、异丙醇、无水乙醇（国药集团有限公司产品），SYBR Green PCR试剂盒、逆转录试剂盒（Thermo公司），RNaseⅠ（Fermentas公司），PCR 引物由上海捷瑞合成。电子天平秤（湘仪天平仪器设备有限公司，TP-2200B），电泳仪（BIO-RAD 公司，mini protean 3 cell），电转仪（大连竞迈科技有限公司，PS-9），酶标仪（芬兰雷勃酶标仪，型号为MK3），吉尔森P型移液器（Pipetman），水浴锅（莱卡公司），旋涡振荡器（上海青浦泸西仪器厂），手握式电动匀浆机 （德国FLUKO公司，F6/10）， 低温冷冻离心机 （Sigma 公司，3K15），Real-time检测仪（ABI公司，ABI-7300），超纯水分离系统（美国LABCONCO 公司，90005-002）。

1.4 分组与造模

采用高脂饲料喂养联合免疫损伤建立兔动脉粥样硬化模型［7-8］：将120只大耳白兔随机分为空白组、模型组、心痛泰高剂量组、心痛泰中剂量组、心痛泰低剂量组、瑞舒伐他汀组（阳性组）各20只。除空白组外，其余组均在造模的第1天开始采用高脂饲料喂养，30 g/（kg·d），每日 2次；并于造模第 1天和第 7天耳缘静脉注射10%牛血清白蛋白（250 mg/kg），同时卵清白蛋白皮下注射，2.5 mg/kg，每2日1次，共5次。

1.5 给药方法

造模的同时予药物灌胃干预治疗，灌胃剂量根据人与兔的体表面积公式换算，心痛泰高、中、低剂量组给药量分别为9.2、4.6、2.3 g/kg，瑞舒伐他汀组给药量为0.55 mg/kg，空白组和模型组予同等体积生理盐水灌胃。灌胃量每次10 mL/kg，连续8周。

1.6 标本采集与检测

实验结束后，予25%乌拉坦4 mL/kg耳缘静脉麻醉，空气栓塞法处死。冰台无菌操作迅速取主动脉弓下2.5~4.0 cm的胸主动脉段，纵行剖开，剪碎置于液氮中冻存，用于HE染色、Western blotting、RT-PCR检测。

1.6.1 Western blotting 检测 TLR4、p38 MAPK、MPO、RhoA、eNOS蛋白的表达 将取出的主动脉组织剪成碎片，按每20 mg组织加入150~250 μL裂解液的比例加入裂解液，匀浆器匀浆直至完全裂解，BCA法测定蛋白质浓度。配胶后上样，进行电泳，采用48 mmol/L Tris、39 mmol/L glycine、0.04%SDS、20%甲醇配置电转缓冲液进行转模，5%脱脂奶粉 （检测磷酸化蛋白用BSA）室温封闭1 h，分别加入适量稀释后抗体RhoA（1∶100）、NF-κB（1∶1000）、eNOS（1∶400）、p38（1∶200）、TLR4（1∶150）、MPO（1∶100）、GAPDH（1∶1500），4 ℃孵育过夜。孵育一抗的膜用TBST洗涤5 min×2次，TBS洗涤 5 min×1次。随后按照1∶1000稀释HRP标记的二抗，与膜37℃孵育1 h。用TBST洗涤5 min×2次，TBS洗涤5 min×1次。加入适量增强化学发光法（ECL）发光试剂，暗室内曝显影，图像分析。

1.6.2 RT-PCR 检测 TLR4、p38 MAPK、MPO、RhoA、eNOS mRNA的表达 取组织置于Trizol的匀浆管中，于匀浆机匀浆20 s，酚-氯仿法提取各组细胞总RNA，测定 RNA 的完整性；37 ℃，30 min；Hold， 加 1 μL 的EDTA；65℃，10 min条件下消除总RNA中的 DNA，37℃，60 min；85℃，5 min；4℃，5 min进行反转录，-20℃保存；以cDNA以模板，与基因特异性引物，通过 PCR 扩增 TLR4、p38 MAPK、MPO、RhoA、eNOS，内参基因选定为GAPDH；采用仪器自带软件ABI Prism 7300 SDS Software测定分析，实验重复3次。引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.7 统计学处理

应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，数据进行正态分布检验及组间方差齐性检验，符合正态分布及方差齐性，采用单因素方差分析；不符合正态分布、方差分析，采用Kruska-Wallis H进行统计处理；组间两两比较采用LSD法。检验水准为0.05。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组兔主动脉组织病理学变化比较

见图1。空白组兔主动脉组织未见粥样斑块，镜下内膜光滑而完整，内皮细胞连续紧密，基本无内膜增厚及斑块形成。模型组兔主动脉动脉肉眼可见大量粥样斑块明显形成，镜下内膜壁明显增厚，形成较大斑块且突出管腔，内膜下大量泡沫细胞聚集及炎性细胞浸润；中膜被破坏，弹性纤维、平滑肌细胞排列疏松紊乱，符合动脉粥样硬化病理学改变，说明高脂饲料饲养联合免疫损伤方法造模动脉粥样硬化兔成功。阳性组肉眼可见极少量粥样斑块，镜下内膜稍增厚，内膜下可见少量泡沫细胞及炎性细胞浸润；内弹性膜未被破坏，中膜完整。心痛泰低剂量组肉眼可见较多粥样斑块，镜下内膜明显增厚形成斑块，可见泡沫细胞聚集及炎性细胞浸润，内膜破坏，与靠近内膜的部分中膜相融合；中膜内弹性纤维、平滑肌细胞排列较整齐。心痛泰中、高剂量组肉眼见少量粥样斑块，镜下内膜增厚较模型组明显减低，内膜下可见泡沫细胞聚集及炎性细胞浸润；内弹性膜未被破坏，中膜完整。

图1 各组主动脉组织病理切片（HE染色，400倍）

2.2 各组TLR4蛋白、TLR4 mRNA表达比较

见表2，图2。与空白组比较，模型组TLR4蛋白、TLR4 mRNA表达升高，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，心痛泰低剂量组TLR4蛋白、TLR4 mRNA表达均降低，但差异无统计学意义 （P＞0.05）；与模型组比较，心痛泰中剂量组TLR4蛋白表达降低，但差异无统计学意义（P＞0.05），心痛泰中剂量组TLR4 mRNA表达降低，差异有统计学意义 （P＜0.05）；阳性组、心痛泰高剂量组TLR4蛋白、TLR4 mRNA表达均降低，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；心痛泰高剂量组TLR4蛋白、TLR4 mRNA表达虽高于阳性组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 各组p38MAPK蛋白、p38 MAPK mRNA表达比较

见表3，图3。与空白组比较，模型组p38 MAPK蛋白、p38 MAPKmRNA表达升高，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，心痛泰低剂量组p38 MAPK蛋白表达降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，心痛泰低剂量组p38 MAPK mRNA表达降低，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，阳性组、心痛泰高、中剂量组p38 MAPK蛋白、p38 MAPK mRNA表达均降低，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；心痛泰高剂量组p38 MAPK蛋白表达高于阳性组，p38 MAPK mRNA表达低于阳性组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组TLR4蛋白、TLR4 mRNA表达比较（±s）

表2 各组TLR4蛋白、TLR4 mRNA表达比较（±s）

与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同

组 别 n TLR4蛋白 TLR4 mRNA空白组 18 0.765±0.055 0.003±0.0003模型组 15 2.283±0.291* 0.017±0.002*阳性组 14 0.951±0.113△△ 0.006±0.001△△心痛泰低剂量组 16 2.158±0.123 0.014±0.001心痛泰中剂量组 15 1.632±0.212 0.010±0.001△心痛泰高剂量组 14 1.090±0.148△△ 0.007±0.001△△

图2 各组TLR4的蛋白表达条带

表3 各组p38 MAPK蛋白、p38 MAPK mRNA表达比较（±s）

表3 各组p38 MAPK蛋白、p38 MAPK mRNA表达比较（±s）

组 别 n p38 MAPK蛋白 p38 MAPK mRNA空白组 18 0.251±0.020 0.008±0.0012模型组 15 1.141±0.152* 0.071±0.005*阳性组 14 0.358±0.023△△ 0.020±0.004△△心痛泰低剂量组 16 0.837±0.099 0.048±0.006△△心痛泰中剂量组 15 0.608±0.038△△ 0.040±0.0033△△心痛泰高剂量组 14 0.370±0.028△△ 0.019±0.003△△

图3 各组p38 MAPK蛋白表达条带

2.4 各组MPO蛋白、MPO mRNA表达比较

见表4，图4。与空白组比较，模型组MPO蛋白、MPO mRNA表达升高，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，心痛泰低剂量组MPO蛋白、MPO mRNA表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，阳性组、心痛泰高、中剂量组MPO蛋白、MPO mRNA表达均降低，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；心痛泰高剂量组MPO蛋白表达虽高于阳性组，心痛泰高剂量组与阳性组MPO mRNA表达相当，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表4 各组MPO蛋白、MPO mRNA表达比较（±s）

表4 各组MPO蛋白、MPO mRNA表达比较（±s）

组别 n MPO蛋白 MPO mRNA空白组 18 0.274±0.018 0.003±0.0005模型组 15 1.914±0.176* 0.024±0.003*阳性组 14 0.355±0.024△△ 0.011±0.003△△心痛泰低剂量组 16 0.706±0.067△ 0.017±0.002△心痛泰中剂量组 15 0.491±0.043△△ 0.014±0.0003△△心痛泰高剂量组 14 0.448±0.033△△ 0.011±0.002△△

图4 各组MPO蛋白表达条带

2.5 各组RhoA蛋白、RhoA mRNA表达水平比较

见表5，图5。与空白组比较，模型组RhoA蛋白、RhoA mRNA表达升高，差异有显著统计学意义 （P＜0.01）；与模型组比较，心痛泰低剂量组RhoA蛋白、RhoA mRNA表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，阳性组、心痛泰高、中剂量组RhoA蛋白、RhoA mRNA表达均降低，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；心痛泰高剂量组RhoA蛋白、RhoA mRNA表达虽高于阳性组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表5 各组RhoA蛋白、RhoA mRNA表达比较（±s）

表5 各组RhoA蛋白、RhoA mRNA表达比较（±s）

组 别 n RhoA蛋白 RhoA mRNA空白组 18 0.543±0.026 0.007±0.0006模型组 15 2.125±0.268* 0.025±0.001*阳性组 14 0.572±0.023△△ 0.011±0.0003△△心痛泰低剂量组 16 1.400±0.156△ 0.019±0.001△心痛泰中剂量组 15 0.748±0.039△△ 0.017±0.0006△△心痛泰高剂量组 14 0.645±0.028△△ 0.014±0.001△△

图5 各组RhoA蛋白表达条带

2.6 各组eNOS蛋白、eNOS mRNA表达的比较

见表6，图6。与空白组比较，模型组eNOS蛋白、eNOS mRNA表达降低，差异有显著统计学意义 （P＜0.01）；与模型组比较，阳性组、心痛泰高、中、低剂量组eNOS蛋白、eNOS mRNA表达均升高，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；心痛泰高剂量组eNOS蛋白表达低于阳性组、eNOS mRNA表达高于阳性组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表6 各组eNOS蛋白、eNOS mRNA表达比较（±s）

表6 各组eNOS蛋白、eNOS mRNA表达比较（±s）

组 别 n eNOS蛋白 eNOS mRNA空白组 18 0.568±0.033 0.019±0.0021模型组 15 0.175±0.013* 0.002±0.0001*阳性组 14 0.567±0.047△△ 0.013±0.001△△心痛泰低剂量组 16 0.336±0.022△△ 0.003±0.0003△△心痛泰中剂量组 15 0.376±0.024△△ 0.006±0.0005△△心痛泰高剂量组 14 0.489±0.058△△ 0.018±0.002△△

图6 各组eNOS蛋白表达条带

3 讨 论

中医无动脉粥样硬化一说，但其多认为，脉为心所主，是奇恒之腑，是气血运行的主要通道，与现代医学的血管在解剖形态上具有同一性，因此多将动脉粥样硬化归属于“脉痹”的范畴。本病主要因外感六淫、情志内伤、饮食劳倦等常导致脏腑气机运行障碍，气机阻滞后常引起血液在脉道中运行异常，脉络瘀阻而发为本病，其病机多为“气滞血瘀，阻滞经络”［9-10］。心痛泰以丹参活血祛瘀止痛，合有“血中气药”之称的川芎共为君药，三七、郁金、木香、山楂共为臣，助君药调畅气机祛瘀止痛，佐以葛根、枳壳，一升一降共调气机。诸药配伍，共奏活血化瘀、理气止痛之功。

Toll样受体是白细胞介素-1受体/Toll样受体超家族的一部分，具有富含亮氨酸重复序列的细胞外N末端配体识别结构域和具有Toll/白细胞介素-1受体（TIR）信号结构域的胞质羧基末端尾。TLR4是toll家族中重要的一员，其与动脉粥样硬化的形成密切相关［11］。p38 MAPK是丝裂原活化蛋白激酶家族中最重要的抗炎成员之一，其可通过渗透性休克、氧化应激等多种炎症反应促进白细胞的聚集和活化，引起血管炎症反应［12］。MPO是炎症及氧化应激标志物，可氧化脂蛋白，引起血管痉挛，损伤内皮细胞，促使斑块糜烂、破裂，促进动脉粥样硬化。同时，MPO通过与结合内皮细胞，跨膜转运到内皮下基质，浸润血管组织，消耗一氧化氮，引起血管内皮舒张功能障碍［13］。RhoA是小G蛋白Ras大家族Rho亚族的成员，是重要的细胞内信号分子，RhoA被激活后可与Rho激酶结合，进一步磷酸化下游底物，从而调节细胞的分泌、增殖等；有研究表明，RhoA蛋白与Rho激酶活化后可抑制血管内皮细胞eNOS的表达［14-15］。血管内皮的损伤是导致动脉粥样硬化的重要原因，而eNOS可依赖氧化应激影响内皮功能和新生内膜形成，在动脉粥样硬化小鼠模型中，发现eNOS解聚导致的超氧阴离子的生成作用显著增加，加速小鼠的动脉粥样硬化斑块的形成［16-17］。

本研究结果显示，心痛泰可降低TLR4、p38 MAPK、MPO、RhoA蛋白及其mRNA的表达水平，升高eNOS蛋白及mRNA的表达水平；且在心痛泰使用到高剂量时，其调控作用更加显著。这可能阐释心痛泰通过降低TLR4、p38 MAPK、MPO等炎症因子，降低与血管内皮功能相关的RhoA表达水平，提高eNOS的表达水平，从而起到减轻动脉粥样硬化炎症反应，保护血管内皮，来起到治疗动脉粥样硬化的作用，且其调控作用与其使用剂量呈正相关。