生物活性肽制备工艺的研究进展

陈丽娜，温宇旗，韩国庆，王耀新，王继明，杜 芳，逯振宇，苏秀兰

（1.内蒙古蒙肽生物工程有限公司研究院，内蒙古呼和浩特 010010；2.内蒙古医科大学临床医学研究中心，内蒙古呼和浩特 010050）

肽是一类分子量介于50～10 000 Da，结构介于氨基酸和蛋白质之间的分子聚合物[1]，经试验证实肽类具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌、降血压、降胆固醇、神经调节、免疫调节等生物活性，故称之为生物活性肽。人们通常根据肽的功能定义活性肽，如抗菌肽、免疫肽、降压肽等，也有根据肽的分子量大小定义肽，分子量＜1 000 Da称为小肽或寡肽，分子量在1 000～5 000 Da的叫多肽，分子量在5 000～10 000 Da的称为大肽，分子量＞10 000 Da的一般为蛋白质。生物活性肽要比母体蛋白质具有更大的活性，肽易于消化，比蛋白质更具生物可利用性，能够调节机体的生命活动，具有特殊的生理功能。

研究表明，肽影响着生物体内许多重要的生理功能，目前已知的100多种内源性生物活性肽参与人体多种生理功能，包括生命活动中的细胞生长、细胞代谢、细胞分化、激素递质调节、肿瘤病变改善、免疫调节、新陈代谢及内分泌调节等生理活动。目前发现并经试验证实的功效有[2-4]：①生物活性肽具有抗氧化、延缓衰老的作用。其原理是捕捉金属离子或促进过氧化物的降解，清除细胞中多余的活性氧，达到抑制脂质过氧化的功效。目前，国内外对肌肽和谷胱甘肽的抗氧化作用机理研究较为明确，其可以作为天然抗氧化物，具有无毒高效等特点。②1979年Christine Z等人首次报道生物活性肽具有神经调节作用，神经活性肽包括类鸦片、内啡肽、脑啡肽，以及其他神经活性肽，与体内的α，β，γ-受体相互作用，可起到镇痛、调节呼吸和体温等功能。③陈彤等人[5]用体外抑菌试验证明了生物活性肽的抗菌作用，抗菌肽是生物体在抵御病原微生物的过程中产生的具有抗微生物和恶性细胞功能的小肽，抗菌肽具有较强的抗菌活性，尤其是对某些耐药性病原菌具有很强的杀伤力，抗菌肽的抗菌机制是非免疫球蛋白型抵御入侵的低分子量蛋白质，通过产酸或是抑制细菌细胞壁合成达到抗菌作用，抗菌肽还可以用于抗病毒、真菌、原虫等。④生物活性肽还具有抗癌[6]、抗血栓、抗高血压、激素作用、免疫调节、感官风味改善、营养保健等功效[7-8]。

1 生物活性肽的制备方法

生物活性肽由于其显著的生物功效，在医药健康领域具有广阔的应用前景，有的在实验室获得了巨大成功，有的已经开发成药品用于临床，还有的在不断探索和改进的过程中。制备高活性、高得率、工艺简便的生物活性肽是肽研究的热门方向。近五六十年来，科学家研究开发的生物活性肽制备方法归结为3类：提取法、合成法和降解法。

1.1 提取法

提取法又分为化学提取法和物理提取法。

1.1.1 化学提取法

化学提取法可用于食品工业的强酸或强碱降解食物大分子蛋白质，待蛋白质中的肽键断裂，终止反应，然后再对产物进行分离纯化。有时也会用到一些有机溶剂进行提取，常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇和正丁醇等。

该方法生产成本低廉，但因为酸碱试剂可对蛋白质造成严重损害，破坏多肽结构，反应程度不容易控制，故无法明确其功能，而且该方法副产物较多、提取步骤繁琐、提取率低，实验室小试还可以实现，无法实现工业化生产。以上多种因素限制了该方法的广泛使用。

1.1.2 物理提取法

物理提取法是近年来提出的新概念[9]，该处理方法不加入任何化学试剂，主要是一种依靠超高压连续细胞流仪器制备多肽的方法，该仪器可以使大肠杆菌细胞破碎程度达到90%以上，所以通过该机器的作用，动植物组织已经全部裂解，且细胞壁、细胞膜已经破裂，胞内活性物质释放，经过连续细胞流裂解成小分子多肽。该方法最大程度地保证了多肽的生物活性，但是对设备要求高、单次处理量小、多肽得率低，不适合工业化生产。

1.2 合成法

合成法包括化学合成法和基因重组法。

1.2.1化学合成法——固相合成

1963年，美国人梅里菲尔德首次发明了固相多肽合成法（SPPS技术）。多肽合成首先要确定出目标肽段中氨基酸的组成及排列顺序，固相多肽合成一般是从C端（羧基端）向N端（氨基端） 重复添加氨基酸的过程[10]。合成法具有下述缺点：①副反应多，不易控制；②产生的肽活性低，多样性差；③固相载体上中间体杂肽无法分离；④链接试剂的毒性残留影响多肽的质量；⑤合成的多肽必须是结构和顺序明确的肽，只能合成已知的，对未知有活性的肽无法合成，所以这大大缩小了多肽的范围。

1.2.2基因重组法

基因重组技术简言之就是将具有功能的目标多肽基因整合到宿主菌中进行克隆表达[11]，通过该方法得到的多肽产量和纯度有很大的提高，是目前大量获得某特定生物活性肽的有效途径之一。该方法在生物医药领域应用广阔。然而，基因重组技术只能合成大分子肽类和蛋白质，对人类主要需求的具有营养价值的小肽，方法不适用，而且与合成法一样，目的片段结构不明确的多肽无法合成。另外，近年来欧美等国消费者普遍反对经过基因生物工程食品、保健食品等。

1.3 降解法

降解法是将大分子量的蛋白质分解为分子量较小结构（较蛋白质简单的肽），包括酶解法和发酵法。

1.3.1 酶解法

酶解法就是蛋白质类物质在蛋白酶的催化作用生成氨基酸和多肽的过程[12]，酶法多肽是当下制备多肽的一个热门技术，是目前制备生物活性肽的主流方法。酶解法制备生物活性肽模拟人体降解蛋白质模式进行体外降解，降解产生的小肽与氨基酸吸收部位不同，不会与体内氨基酸的吸收产生竞争。目前常用的工业化生产的蛋白酶有胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶、胶原蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶和复配酶等。

酶解法的优点包括：①制备的生物活性肽性能比较稳定，在酸性条件和较高温度时稳定性良好；②相对于化学提取法，酶解法可利用的蛋白质资源多、酶解工艺操作简单、提取周期快、酶解程度容易控制；③酶解法采用特定的蛋白酶，有目的地剪切肽段，以获得所需功能活性的生物多肽[13]，同时多肽产量相对化学提取法也有很大的提升。在酶解法制备生物活性多肽的过程中，该方法最主要的是控制蛋白酶的添加量、温度和体系的酸碱度，将蛋白物质水解成生物多肽混合物后，再进一步进行生物活性多肽的分离。

酶法法的缺点主要是：酶解法制备生物活性肽的过程均会产生苦味肽，蛋白质在酶解过程中会产生一些疏水性氨基酸，这些疏水性氨基酸和舌尖上的苦味受体结合便会产生苦味。酶解蛋白苦味的普遍存在性，使生物活性肽的应用受到很大的影响。一些研究者通过活性炭或硅藻土作为吸附剂分离苦味肽，也尝试用外切酶切除苦味肽，或者采用醇提法，利用环糊精或多磷酸盐等对低分子苦味肽进行络合处理等方式进行脱苦，现在不少学者正在采用复合酶水解的方式，用3种或2种以上的酶酶解同一底物，或是引入风味蛋白酶试图改变酶解产物的口感[14]。

复合酶酶解案例见表1。

表1 复合酶酶解案例

复合酶酶解效果好，得到的多肽活性高，且具有多样性，但是该法只能适应1～2种蛋白质的催化降解，不能适应多种动植物蛋白的降解，需要根据不同的动植物蛋白质结构配制不同的复合酶，使用具有局限性。不论是单一酶酶解后再进行脱苦处理，还是复合酶酶解均存在着多肽产量较低、工艺复杂、成本较高等问题。

1.3.2 发酵法

发酵法，是在以上方法研究成熟的基础上提出的一种新的制备生物活性肽方法，成为近年来研究肽制备工艺的热点。该方法是通过菌种在生长代谢过程中产生的蛋白酶水解底物蛋白，底物蛋白不仅受到蛋白酶的水解作用，同时还受到发酵菌种的侵蚀作用，均会在一定程度上分解产生分解产物。底物蛋白既为细菌的生长繁殖提供营养物质，也是细菌分解的目标产物，构建了一个微生态反应圈，通过微生物发酵过程产生的蛋白酶（复合）降解蛋白质，可达到较高的水解度，从而相对降低酶法生产低聚肽的成本，并且可以利用微生物中的肽酶除去苦味肽，用于普通食品和功能性食品生产领域。发酵法制备生物活性肽有很多优点[18]，蛋白酶来源广、繁殖快、产量高、成本低，且得到的生物活性肽分子量较小，具备更优良的生物活性、发酵工艺简单、生产成本低、更易于产业化等，故应用前景广阔。

发酵法的优点有：①活性微生物菌体直接参与蛋白降解的生化代谢，底物蛋白既为微生物生长代谢提供能量，又是微生物代谢产物酶的作用底物，这样的结构体系可减少废物排放，使资源得到充分利用；②活性微生物菌体的生化代谢产物可以修饰某些功能基团[19]；③活性微生物菌体本身经过代谢可以合成、分泌小肽物质；④微生物发酵法不同于酶法，酶法是简单地切割固定的肽键，而发酵法通过微生物代谢产生的复合酶系，可以酶解释放出高浓度特定的活性肽，酶解效率高；⑤微生物的代谢发酵可以合成多种复杂的初级代谢产物和次级代谢产物，但酶法不能[20]；⑥发酵过程中有大量的菌体细胞生长繁殖，微生物菌体的细胞壁主要成分是乙酰葡萄糖胺和乙酰胞壁酸，是细菌的一种特殊物质，在其他任何生物体内均不存在，所以微生物菌体除具有营养作用外，还对生物体的免疫功能具有刺激作用[21]；⑦与酶法相比，微生物发酵法制备得到的生物活性肽水解度可提高10%～20%[22]；⑧发酵制备活性多肽的过程中，底物不仅受到蛋白酶的酶解作用，同时还受到菌的侵蚀作用，发酵产物比发酵原料的蛋白质增加4.53倍，比氨基酸增加1.43倍，而且通过发酵可以很好地平衡产物的氨基酸比例。

但微生物发酵法也有一些缺点：很多的产酶菌有毒或对人体有害，目前已经证明无毒、可以用于食品开发的菌种并不多，安全问题、作用机理成为阻碍微生物发酵法制备活性肽的最大障碍。一些特殊功能的肽不是简单的单一细菌代谢产物酶就可以降解的，而是需要根据生物活性肽的结构选择符合要求的复合酶，微生物发酵产生复合酶体系酵解产生活性肽的机理尚未完全阐明，若可以阐明其中的作用机理，发酵法将比复合酶解法效率更高。

2 发酵法制备生物活性肽的应用实例分析

发酵技术广泛应用于医药、工农业、环保等诸多领域。通过发酵法制备活性肽应用于生物制品、食品制造业等，发酵底物通常为动物制品，如动物脏器、骨头、深海鱼肉及各种动物蛋白等，植物作为发酵底物有豆粕、豆、植物籽、各种粮食作物等，发酵制备活性肽常用菌种有霉菌，如黑曲霉、米曲霉菌等；细菌，如主要用来产生中性蛋白酶和碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌[23]，以及主要用来产生酸性蛋白酶的乳酸菌、嗜热乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌等；产朊假丝酵母；黏质沙雷氏菌，主要产生一种具有消炎作用的金属酶SMP；多黏芽孢杆菌，主要产生一种能够特异性地降解纤连蛋白和IV型胶原蛋的中性蛋白酶；有去除腥味功效的酵母菌[24]。发酵法制备生物活性肽应用领域广阔，底物来源丰富多样，而且均为食源性蛋白质，安全有保障、营养丰富，发酵菌种种类繁多、功能各异，可以通过发酵制备出具有多种生理功能和多种来源的生物活性肽。

2.1 发酵制备牛乳蛋白多肽

牛乳含有丰富的蛋白质和多种氨基酸，是一种优质的动物蛋白源。最近研究发现[25]，牛乳含有的天然蛋白肽中有些具有活性，如表皮生长因子（EGF）、转化生长因子（TGF）等，在人体健康中起着重要作用。研究证明，乳源活性肽食用安全，利用瑞士乳杆菌对牛乳蛋白进行发酵，产生具有提高机体免疫力的以酪蛋白肽为主要物质的小分子多肽混合物。国外市场已有较多的乳源肽成熟产品，我国在1990年开始在该领域进行研究，研制出具有提高人体钙、铁、锌等二价矿物质的摄入量和利用率的酪蛋白磷酸肽。

2.2 发酵制备豆类肽

发酵豆制品通常包括纳豆、大酱、黄豆饼、酱油、腐乳、豆豉和豆瓣酱等[26]，通过发酵使大豆蛋白分解，产生大量氨基酸和风味酶，均衡营养比例，调整食品风味，生物利用率上升，促进人体吸收。在发酵过程中，结构复杂、分子量较大的大豆蛋白在微生物分泌的蛋白酶作用下可以水解释放出多种氨基酸序列不同的生物活性肽，而且在自身蛋白酶催化下还可以合成新的多肽序列。发酵豆制品产生的生物活性肽可以与细胞受体相互作用，发挥多种的生物学功能，如抗氧化、降血糖、抗菌、抗癌、降血压等[27-29]。

2.3 发酵制备各种饼粕多肽

花生、芝麻、大豆、棉籽、蓖麻、亚麻籽、菜籽、葵花籽等饼粕是经榨油后的碎片状或粉状副产物，其中蛋白含量占干质量的30%～50%。饼粕蛋白中氨基酸齐全，必需氨基酸含量适中，是一种优质的蛋白资源。经验证[30]，在最优发酵条件下核桃活性肽得率可达35.68%，该活性肽在体外具有抗氧化活性，可清除DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子。目前文献[31-32]报道的有发酵棉籽、油茶、菜籽这3种饼粕，发酵产物用作动物饲料，可以降低饲料成本，且营养价值显著提高。

2.4 发酵动物血液制品制备活性肽

研究表明[33]，血多肽有降血压和11.36%，必需氨基酸的总量提高了16.43%，花生粕的品质得到了明显提高。增强免疫力的生物活性，而且血红素肽是一种优良的铁补充剂。在欧洲等发达国家，动物血液的利用率已达50%以上，主要开发肽类试剂、肽类药物，以及功能食品和食品添加剂，如奥地利爱维治小牛血去蛋白提取物就是临床上应用非常广泛的血液肽制品。湖南农业大学方俊等人通过筛选高产酶菌株发酵制得猪血多肽，并对其清除活性氧能力、降血脂活性进行了相关研究，采用3株枯草芽孢杆菌经过驯化后，在适宜的条件下，发酵猪血粉蛋白，最终经分离得到具有活性的猪血多肽。与底物猪血粉蛋白相比，猪血多肽分子量大小、氨基酸种类及组成发生了变化。小分子猪血肽具有溶解性好、黏度低、抗凝胶形成和体内消化快、可直接吸收等特点。

2.5 发酵动物脏器制备活性肽

经查阅文献可知，目前用于发酵研究的动物脏器有已经广泛用于临床的脾多肽，也有掀起美容和保健热潮的羊胎盘、鹿胎盘，还有以肝脏为原料进行多肽研究的，通过文献检索找到一篇名为“一种肝蛋白多肽的结肠靶向制剂及其制备方法”的专利，但是关于利用动物脏器制备生物活性肽的报道还是很少。侯银臣等人[34]利用枯草芽孢杆菌对羊胎盘进行发酵，制备生物活性肽，研究了发酵过程中蛋白酶活性，发酵产物的平均肽链长度及分子量大小，同时对产物的抗氧化和免疫活性进行了研究，实现了可控制发酵羊胎盘制备免疫活性肽的技术，试验证明羊胎盘活性肽还具有抗氧化作用。脾多肽在临床上应用广泛且疗效显著，药用脾多肽的制备方法是直接提取法，目前还没有报道通过发酵法制备脾多肽的方法，未来发酵法制备脾多肽也是一个获得活性小分子多肽的不错选择。鲜有报道利用动物肝脏制备多肽的，目前通过文献检索找到一篇名为“一种肝蛋白多肽的结肠靶向制剂及其制备方法”，肝脏多肽的研究目前几乎是空白，更没有通过发酵法制备肝脏多肽的研究报道，对于做动物脏器多肽的企业或研究单位这是一个有效的切入点。

2.6 发酵制备动物骨肽

利用动物骨骼发酵制备动物骨肽的应用较为广泛，主要有鹿骨、驴骨、各种深海鱼骨、牛骨、牦牛骨、羊骨、畜禽软骨等，常被做成骨泥或骨粉，用酶解法降解制备生物活性肽或回收蛋白质。目前，有关于发酵法制备骨多肽的报道甚少，发现2篇发酵制备牛骨多肽的文章，在牛骨的功能性开发利用方面，多以牛骨的蛋白质利用和钙的转化为主。唐勇等人[35]利用肠道中的有益菌——乳酸菌对超微骨粉进行发酵，发现骨粉被研磨后颗粒的大小与发酵后牛骨粉产生的游离钙离子量和游离氨基酸量存在相关性，在最佳工艺下，骨粉中蛋白质的最大水解率为63%，骨粉中结合钙的最大游离转化率为37%。郭耀华，刘丽莉等人[36-37]利用蜡样芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌混合发酵牛骨粉，制备牛骨血管紧张素转换酶抑制肽，而且通过发酵可以使碳酸钙活化为游离的钙离子，口服易于人体钙的吸收。通过发酵使骨骼中的多种氨基酸含量达到均衡，且释放出大量具有生物功能的活性多肽。付文雯[38]研究了牛骨胶原多肽螯合钙的制备和其结构的表面特征，骨中含有骨肽，骨肽中具有多肽、骨代谢调节因子：软骨源性生长因子，转化生长因子，骨生长因子，骨源性生长因子，成纤维细胞生长因子，γ-干扰素，白细胞介素-6等。对调节骨代谢、刺激成骨细胞再生、促进新骨形成均有效果，同时对防治骨质疏松具有一定的疗效。利用微生物的作用降解骨粉中的蛋白质[39]，能够使部分钙从结合态游离出来，变成游离钙。该法具有酶解、酸碱水解、基因工程等方法的共同作用，因此微生物发酵法是一种新的有效制备生物活性肽方法。

3 结语

生物活性肽由于其多种多样的生物功能，被许多研究者广泛研究，从发现至今，研究者不断挖掘出生物活性肽的多种生理功能，不断创新出多种制备方法，对生物活性肽的理化性质也有了深入的了解，生物活性肽的组成、排列顺序和肽链长度不同，导致了不同的溶解度、脂质结合型、发泡性、乳化性，同时也在不断发掘新型制备活性肽的原料从植物性原料，到动物性原料，再到几年前研究火热的以海洋生物为原料制备活性肽，现阶段综合考虑产品功效、环境压力及深化产业链问题提高农副产品附加值等问题，有的研究机构以动物脏器这些低值边角料为原料研究制备生物活性肽，且生物活性显著。生物活性肽的高效制备工艺是实现活性肽产业化的关键，虽然目前国内外很多实验室都在研究生物活性肽的制备工艺，但大规模生物活性肽的商品化应用依然存在着许多问题和障碍，所以研究者对于生物活性肽新型高效制备工艺和低成本、高纯度、大批量生产的工程化研究也会越来越深入。生物活性肽的研究与开发仍具有广阔的发展前景。

利用食源性的动物骨粉、骨泥制备生物活性肽[40-41]，寻找驯化适宜的益生菌，通过发酵制备骨多肽，然后对发酵产物按分子量大小进行分离，验证各个多肽片段的功能，制备符合人体氨基酸比例的活性多肽是多肽研究的一个新选择[42-44]。以食源性物质为原料制备活性肽时，首先保证人体食用的安全性，其次营养保健功能丰富，还可以增加动物骨骼的利用率，生化产业链，原料价廉易得，可很好地控制生产成本，益生菌发酵产品是现代养生保健的热门话题，如风靡日本又传入我国的纳豆，就是大豆经过纳豆菌发酵而成的一种健康产品，益生菌[45-46]本身是平衡肠道微生态的有益菌群，发酵技术就是将生物体进行有机物分解的过程，动物骨泥经过益生菌发酵分解成多种生物活性肽，可解决发酵法存在的安全问题和不可控性，这为生物活性肽的研究与开发提供了新的研究方向，同时为功能性保健食品的开发提供新原料和新思路。