浓缩苹果汁中微生物染菌的种类及防治研究

王 楠，臧汝瑛，周宏霞

（威海市食品药品检验检测中心，山东威海 264209）

苹果是我国广泛栽培的一种水果，深受广大消费者喜爱。苹果中的营养成分及功能性成分种类众多，有糖类、果胶、纤维素、有机酸、单宁及各种金属离子，具有补中益气、开胃制酸、润肺悦心等功效[1]。在我国，苹果除了部分鲜食外，大部分通过蒸发浓缩或者膜分离加工成浓缩苹果汁，进而制作成各种饮料[2]。

浓缩苹果汁的终点质量分数一般为40%～50%，目的是为了便于运输，以及增加渗透压不容易染菌[3]。然而，微生物染菌仅仅是相对的，在浓缩苹果汁的运输及贮藏过程中，出现酒味的现象往往意味着其中有了微生物在发酵，如果不能及时加工成产品，酒味会转变成酸味，甚至不良的臭味[4]。微生物染菌现象在炎热的夏季尤为严重，一直是果汁工业要努力解决的难题。试验对浓缩苹果汁中的微生物进行了分离培养，确定了容易染菌的种类，并对其防治措施进行了初步研究，对于浓缩果汁的保鲜具有重要的指导意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

浓缩苹果汁，购于威海农贸市场；纳他霉素，由浙江新银象生物工程有限公司提供；葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、焦亚硫酸钠等试剂，均为分析纯。

琼脂培养基[5]：葡萄糖10 g/L，酵母抽提物2 g/L，胰蛋白胨5 g/L，琼脂20g/L，初始pH值7.0。于121℃条件下灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 苹果汁中微生物的培养

在超净工作台中倾倒琼脂平板，备用。用移液枪吸取浓缩苹果汁200 μL涂布平板，枪头事先灭菌并用脱脂棉包口。平板倒扣于恒温培养箱中，于35℃条件下培养36 h，观察平板菌落情况。

1.2.2 摇瓶培养微生物并显微镜观察[6]

用接种环挑取单菌落2环至灭菌的液体培养基中，液体培养基的成分与琼脂培养基相同，但不含琼脂。于35℃条件下摇床培养，转速200 r/min，培养时间24 h。培养完毕后吸取1滴菌液置于载玻片上，盖上盖玻片，在10×40倍的显微镜下观察微生物的形态。

1.2.3 焦亚硫酸钠对酵母菌的抑制效果[7]

液体培养基灭菌后，吸取不同量的焦亚硫酸钠浓溶液至摇瓶中，使其总使用量分别为300×10-6，500×10-6，1 000×10-6，再接种1 mL的酵母菌液作为种子，并以不加焦亚硫酸钠作为对照，于35℃条件下摇床培养，转速200 r/min，培养时间24 h，观察酵母菌的增殖情况。

1.2.4 纳他霉素对酵母菌的抑制效果[8]

液体培养基灭菌后，吸取不同量的纳他霉素浓溶液至摇瓶中，使其总使用量分别为2×10-6，5×10-6，10×10-6，再接种1 mL的酵母菌液作为种子，并以不加纳他霉素作为对照，于35℃条件下摇床培养，转速200 r/min，培养时间24 h，观察酵母菌的增殖情况。

2 结果与分析

2.1 浓缩苹果汁中微生物的平板培养

根据浓缩苹果汁的贮藏时间，先后取样进行了微生物的培养，其贮藏时间分别为7，15，30，50 d。首先从气味方面考查，贮藏7 d的果汁没有明显的酒味，也没有异味，但是在培养微生物的平板上仍然有菌落生长，见图1（a），而且在平板上却产生了明显的酒精味，说明染菌大部分是酵母菌，同时也有少量霉菌生长出来，且通过平板计数，酵母菌数量占比约80%。贮藏了15 d的果汁，生长出的酵母数量要比7 d的多，见图1（b），约为600个/mL，基本上全是酵母菌，霉菌没有生长出来。而对于存放30 d和50 d的苹果汁，其酒精味很浓烈，说明酵母菌增殖到了一定程度，已经严重引起了果汁的质变，微生物培养结果也证实了这一点，酵母菌数量高达3 000个/mL，见图1（c） 和图1（d）。

从浓缩苹果汁中培养出的微生物菌落见图1。

2.2 摇瓶培养浓缩苹果汁中的微生物

图1 从浓缩苹果汁中培养出的微生物菌落

将平板上的部分单菌落接种至摇瓶中进行液体培养，以观察微生物的类型。结果发现，从苹果汁中分离出来的微生物增殖能力很强。由图2（a） 可知，刚刚接种菌液时的液体培养基依然很清亮透明，说明微生物的数量还比较少，然而仅仅经过了24 h的培养，各个摇瓶中的培养基变得非常浑浊，见图2（b），OD值从初始的0.4急剧升高至42.5。果汁中染菌微生物的增殖能力强，也从侧面证实了控制果汁保鲜的难度较大。

摇瓶培养微生物的增殖情况见图2。

图2 摇瓶培养微生物的增殖情况

从摇瓶培养基的气味考查，每瓶都散发着浓浓的酒精味，还夹杂一些其他芳香气味，但是每瓶中的气味也有差异。通过显微镜观察，基本确定染菌的大多数是酵母菌，但是酵母菌的种类和形态并不单一。

显微镜观察摇瓶中微生物的形态见图3。

图3 显微镜观察摇瓶中微生物的形态

由图3可知，有的酵母菌呈椭球状，见图3（a）；有的呈球形，见图3（b）；有的呈长杆状或者节状，见图3（c）。对于图3（d），其中的微生物种类繁多，呈丝状的是霉菌，大球形的是酵母菌，而非常细小的呈点状的则为细菌类。总之，通过对浓缩果汁中染菌微生物的调研，可以得知其中数量最多的是酵母菌，占总菌落数的80%；霉菌数量次之，占15%；而细菌类数量最少，占5%。

2.3 焦亚硫酸钠对酵母菌的抑制作用

既然清楚了浓缩苹果汁容易染菌，也对其中的微生物种类进行了调研，接下来对浓缩果汁的防腐保鲜作了进一步研究。目前，果汁在运输及贮藏中常用的抑菌剂是焦亚硫酸钠（简称焦亚）。焦亚的化学式是Na2S2O5，是一种酸性物质，一般认为其防腐抑菌机理是与水反应放出SO2，进而生成亚硫酸[9]。根据GB 2760对于焦亚的使用规定，焦亚在果蔬汁中的最大使用量为0.05 g/kg，浓缩果蔬汁按浓缩倍数折算，估算约250×10-6。为了确定焦亚是否对浓缩果汁中的酵母菌有抑制效果，研究对其使用量进行了试验[10]。

不同焦亚硫酸钠使用量对酵母菌的抑制作用见图4。

图4 不同焦亚硫酸钠使用量对酵母菌的抑制作用

由图4可知，焦亚的使用量分别为0，300×10-6，500×10-6，1 000×10-6，接种酵母菌经过 24 h培养后，对照组（0） 摇瓶中的菌液非常浑浊，OD值为46.3。焦亚使用量为300×10-6的试验组，从外观上看与对照组区别不大，OD值为42.7，说明焦亚几乎没有发挥出抑菌作用。当焦亚使用量达到500×10-6时，试验组摇瓶的OD值为38.2，虽然能够体现出其对酵母菌有所抑制，但很明显抑菌效果并不强烈。甚至当焦亚使用量高达1 000×10-6时，OD值也只是降低至21.6，远远没有达到试验预期的抑菌效果。这实际上是我国食品工业中防腐剂使用的一个缩影，即在国标规定的范围内，很多防腐剂达不到理想的抑菌效果[11]。

2.4 纳他霉素对酵母菌的抑制作用

纳他霉素是一种微生物发酵生产的防腐剂，其专一性的抑制酵母和霉菌，具有良好的物理和化学稳定性，与乳酸链球菌素、聚赖氨酸一起称为三大生物型防腐剂[12]。根据我国GB 2760规定，纳他霉素可以应用于干酪、肉制品、糕点、果蔬汁等食品的防腐中，在果蔬汁中的使用量最高为0.3 g/kg，即300×10-6；在发酵酒中的使用量最高为0.01 g/L，即10×10-6。为了确定纳他霉素是否对浓缩果汁中的酵母菌有抑制效果，研究对其使用量进行了试验[13]。

不同纳他霉素使用量对酵母菌的抑制作用见图5。

图5 不同纳他霉素使用量对酵母菌的抑制作用

由图5可知，纳他霉素的使用量分别为0，2×10-6，5×10-6，10×10-6，接种酵母菌经过 24 h培养后，对照组（0） 摇瓶中的菌液非常浑浊，OD值为44.8。纳他霉素使用量为2×10-6的试验组，从外观上看与对照组有明显不同，还是呈现刚接种时澄清的状态，其OD值从初始的0.45仅仅增长至0.84，说明纳他霉素对酵母菌的抑制作用非常强烈，仅仅2×10-6就达到了理想的效果。后续2个试验组，使用纳他霉素5×10-6和10×10-6的摇瓶中，酵母菌同样也没有繁殖起来，OD值分别为0.82和0.78。这说明纳他霉素可以作为浓缩苹果汁保鲜的有效防腐剂。

3 结论

浓缩苹果汁的质量分数一般为40%～50%，鉴于浓缩技术及质量指标，其质量分数不能再高，因此相比于果葡糖浆或者麦芽糖浆75%的质量分数，浓缩果汁质量分数偏低。而且由于苹果汁中含量较高，大部分糖分为葡萄糖、果糖、蔗糖等，均为易发酵成分[14]，所以在运输及贮藏过程中容易发生染菌。研究发现，浓缩苹果汁中染菌微生物绝大多数为酵母菌，少数为霉菌，而细菌类数量较少。针对于酵母菌和霉菌，研究选择了专一性的抑菌剂纳他霉素，使用量仅仅2×10-6即表现出了强烈的抑菌作用和防腐效果，这就为浓缩果汁的保鲜提供了有效的解决方案。此外，从应用成本角度考虑，纳他霉素的市场价格以500元/kg计算，即使按照5×10-6的使用量，每1 m3果汁中纳他霉素的使用量为5 000 mg，即5 g，折合成本为2.5元/m3，这对于果汁工业是很容易接受的。而且，纳他霉素作为一种安全、高效的食品防腐剂，将会在食品工业中发挥越来越重要的作用[15]。