HPLC双波长法测定小柄马勃子实体、液体发酵菌丝中麦角甾醇和麦角甾酮含量

杨秀璐，孟佳启，李 婷，王淑敏 *

（1．长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117；2．吉林延边朝药药业有限公司，吉林 延边 133000）

中药马勃Lycoperdonspp．属于马勃目（Lycoperdales） 马勃属（Lycoperdon） 大型药用真菌，广泛分布于世界各地。现代研究表明，马勃具有止血、抗溃疡、抗炎等诸多药理功效[1－3]。其化学成分主要有甾体类化合物、萜类化合物、小分子含氮化合物、多糖、微量元素等[4－8]。本试验的研究对象小柄马勃Lycoperdon pedicellatusPeck．是马勃真菌中非常独特的1种，因其野生资源较少，且马勃品种繁多，所以小柄马勃在国内外少有报道。甾体类成分是小柄马勃的主要活性成分，本试验通过建立小柄马勃高效液相双波长法，对其子实体与液体发酵菌丝中麦角甾醇和麦角甾酮含量进行分析，比较子实体和液体发酵菌丝之间的含量差异，为小柄马勃和发酵菌丝的质量控制和进一步开发其食（药）用价值提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC－20AT高效液相色谱仪，岛津国际贸易上海有限公司；W201S恒温水浴锅，上海申生科技有限公司；EL204电子天平，梅特勒－托利多国际贸易上海有限公司；KQ－250B超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；岛津AUY220分析天平，岛津国际贸易上海有限公司；ABB5－S十万分之一电子天平，梅特勒－托利多国际贸易上海有限公司。

1.2 试验药品

麦角甾醇与麦角甾酮标准品，均购自上海源叶生物科技有限公司，麦角甾醇批号：J26M6K1，纯度≥98%；麦角甾酮批号：X19M9L56204，纯度≥98%。色谱甲醇，美国fisher公司。其他试剂均为分析纯。小柄马勃子实体，采自长春市净月潭国家森林公园，经长春中医药大学王淑敏教授鉴定为小柄马勃Lycoperdon pedicellatusPeck．；小柄马勃液体发酵菌丝，由长春中医药大学菌物药研究室提供。

2 方法

2.1 样品的制备

2．1．1 对照品溶液的制备

精密称取2份不同质量的麦角甾醇对照品，加入甲醇溶解，定容于10 mL容量瓶中，分别得浓度为 0．02 mg·mL－1与 0．305 mg·mL－1的麦角甾醇对照品溶液。精密称取麦角甾酮对照品适量，加入甲醇溶解，定容于 10 mL 容量瓶中，得浓度为 6．54 μg·mL－1麦角甾酮对照品溶液。

精密吸取 0．02 mg·mL－1麦角甾醇对照品溶液与6．54 μg·mL－1麦角甾酮对照品溶液按 1∶1 配置，最终得麦角甾醇 0．01 mg·mL－1、麦角甾酮 3．27 μg·mL－1混合对照品溶液 1；精密吸取 0．305 mg·mL－1麦角甾醇对照品溶液与 6．54 μg·mL－1麦角甾酮对照品溶液按1∶1 配置，最终得麦角甾醇 0．1525 mg·mL－1、麦角甾酮 3．27 μg·mL－1混合对照品溶液 2。

2．1．2 小柄马勃子实体供试品溶液的制备

精密称取小柄马勃子实体38．70 mg，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入20 mL二氯甲烷，称重，超声30 min，再次称重，用二氯甲烷补足减失的重量，摇匀，过滤，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇溶解定容到1 mL的容量瓶中，即得麦角甾醇和麦角甾酮混合供试品溶液1。

精密称取小柄马勃液体发酵菌丝2．0098 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入50 mL二氯甲烷，称重，超声30 min，再次称重，用二氯甲烷补足减失的重量，摇匀，过滤，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇溶解定容到5 mL的容量瓶中，即得麦角甾醇和麦角甾酮混合供试品溶2。

2.2 色谱条件

2．2．1 小柄马勃子实体色谱条件

使用 Inertsil ODS－SP C18柱 （4．6 mm×250 mm，5 μm） 色谱柱，柱温：30℃；流动相：甲醇；流速：0．8 mL·min－1；检测波长：麦角甾醇与麦角甾酮分别为282 nm、349 nm；进样量：18 μL；理论塔板数不低于 3 000[9－11]。

2．2．2 小柄马勃液体发酵菌丝色谱条件

色谱条件除进样体积为10 μL外，同2．2．1项下小柄马勃子实体色谱条件。

3 结果

3.1 小柄马勃子实体HPLC色谱图

小柄马勃子实体HPLC色谱图见图1～图4。

如图1～图4所示，供试品溶液1中麦角甾醇与麦角甾酮的保留时间，能够分别与混合对照品1中麦角甾醇与麦角甾酮的保留时间相对应，且保留时间适宜，峰型良好，证明方法稳定可靠。

3.2 小柄马勃液体发酵菌丝HPLC色谱图

小柄马勃液体发酵菌丝的HPLC色谱图见图5～图8。

如图5～图8所示，供试品溶液2中麦角甾醇与麦角甾酮的保留时间，能够分别与混合对照品2中麦角甾醇与麦角甾酮的保留时间相对应，且保留时间适宜，峰型良好，证明方法稳定可靠。

3.3 方法学考察

3．3．1 线性关系考察

按照2．2．1项下色谱条件，取混合对照品1溶液2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL、16 μL、18 μL、20 μL，注入液相色谱仪，进行测定。以峰面积值（A） 为纵坐标（Y），以含量（μg）为横坐标（X），得麦角甾醇线性回归方程为Y=1 460 264.17X-13 806.86（r=1），结果表明进样量在0.02 μg～0.20 μg （r=1） 范围内呈现良好的线性关系。

图2 混合对照品溶液1麦角甾酮HPLC图Fig.2 Chromatogram of ergosterone in mixed control solution 1

图3 供试品溶液1麦角甾醇HPLC图Fig.3 Chromatogram of ergosterol in sample solution 1

图4 供试品溶液1麦角甾酮HPLC图Fig.4 Chromatogram of ergosterone in sample solution 1

图5 混合对照品溶液2麦角甾醇HPLC图Fig.5 Chromatogram of ergosterol in mixed control solution 2

图6 混合对照品溶液2麦角甾酮HPLC图Fig.6 Chromatogram of ergosterone in mixed control solution 2

图7 供试品溶液2麦角甾醇HPLC图Fig.7 Chromatogram of ergosterol in sample solution 2

图8 供试品溶液2麦角甾酮HPLC图Fig.8 Chromatogram of ergosterone in sample solution 2

取混合对照品 2 溶液 2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL、16 μL、18 μL、20 μL，注入液相色谱仪，按照“2.2.2”项下条件进行测定。以吸收峰面积值（A） 为纵坐标（Y），以质量（ng） 为横坐标（X），分别得麦角甾醇线性回归方程Y=1 696 290.87X-8 894.47（r=1） 与麦角甾酮线性回归方程Y=8 291.78X-3 402.08（r=1）。结果表明进样量分别在 0．305 μg～3．05 μg （r=1）、6．54 ng～65．4 ng（r=1） 范围内呈现良好的线性关系。

3．3．2 精密度考察

按照2．2．2项下色谱条件，取10 μL麦角甾醇对照品溶液，注入高效液相色谱仪，重复测定6次。麦角甾醇峰面积值分别为2 187 971、2 192 214、2 195 844、2 197 362、2 197 958、2 195 471，经计算RSD值为0．17%，证明仪器精密度良好。

3．3．3 稳定性考察

分别取小柄马勃子实体供试品与小柄马勃液体发酵菌丝供试品溶液，进样量为10 μL，分别在0、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h注入高效液相色谱仪，按照2．2．1项下色谱条件进行检测。小柄马勃子实体中麦角甾醇的峰面积值分别为24 978、25 010、24532、 25 332、 24 699、 25 634， RSD 值 为1．61%；麦角甾酮峰面积值分别为37 105、35 968、37 824、36 947、37 232、37 562，RSD 值为 1．73%。结果表明样品在24 h内稳定。小柄马勃的液体发酵菌丝中麦角甾醇的峰面积值分别为4 005 685、4 039 567、4 026 428、4 028 641、4 027 801、4 015 295，RSD值为0．29%；麦角甾酮的峰面积值分别为 91 823、91 850、93 468、91 931、93 754、92 185，经计算RSD值为0．94%，结果表明样品在24 h内稳定。

3．3．4 重复性考察

取同一批小柄马勃子实体与小柄马勃液体发酵菌丝各6份，按照2．1．2项下供试品溶液制备方法制备，按照2．2．1项下色谱条件进行检测。测得小柄马勃子实体麦角甾醇的含量分别为 58．1073 μg·g－1、58．1879 μg·g－1、 57．7445 μg·g－1、 57．5793 μg·g－1、58．0 198 μg·g－1、57．3287 μg·g－1，RSD 值为 0．58%；麦角甾酮含量分别为 12．3055 μg·g－1、12．2099 μg·g－1、12．1727 μg·g－1、 12．2454 μg·g－1、 12．1613 μg·g－1、12．2811 μg·g－1，RSD 值为 0．48%。小柄马勃液体发酵菌丝中麦角甾醇的含量分别为 0．5917 mg·g－1、0．5890 mg·g－1、 0．5927 mg·g－1、 0．5925 mg·g－1、0．5939 mg·g－1、0．5936 mg·g－1，RSD 值为 0．30%；麦角甾酮的含量分别为 2．8711 μg·g－1、2．8647 μg·g－1、2．8979 μg·g－1、2．8642 μg·g－1、2．8845 μg·g－1、2．8745 μg·g－1，RSD 值为 0．45%，结果表明该方法重复性良好。

3．3．5 回收率考察

精密称取已知麦角甾醇含量与麦角甾酮含量的小柄马勃子实体与液体发酵菌丝供试品各6份，分别加入一定量的麦角甾醇与麦角甾酮标准品，按照2．1．2 项下方法制备样品，按照 2．2．1 项下条件进行检测，结果见表1～表4。

表1 子实体麦角甾醇回收率试验（n=6）Tab．1 Recovery rate of ergosterol in fruiting body(n=6)

表2 子实体麦角甾酮回收率试验（n=6）Tab．2 Recovery rate of ergosterone in fruiting body(n=6)

表3 液体发酵菌丝麦角甾醇回收率试验（n=6）Tab．3 Recovery rate of ergosterol in liquid fermentation mycelium(n=6)

表4 液体发酵菌丝麦角甾酮回收率试验（n=6）Tab．4 Recovery rate of ergosterone in liquid fermentation mycelium(n=6)

如表1～表4所示，小柄马勃子实体中麦角甾醇与麦角甾酮的平均回收率分别为99．53%和96．80%，加样回收率的RSD值分别为1．21%和1．55%，小柄马勃液体发酵菌丝中麦角甾醇与麦角甾酮的平均回收率分别为97．84%和98．89%，加样回收率的RSD值分别为1．65%和1．91%，其回收率和相对标准偏差均在限度范围内，表明样品回收率高，方法准确、良好。

3．3．6 样品含量测定

取小柄马勃子实体与液体发酵菌丝，按照“2．1．2”项下方法制备样品，按照“2．2．1”项下色谱条件进行含量测定，记录吸收峰面积。小柄马勃子实体中麦角甾醇的峰面积值分别为45 301、45 383、44 932，麦角甾酮的峰面积值分别为67 675、67 123、67 328，其平均含量分别为 58．01 μg·g－1、12．25 μg·g－1。小柄马勃液体发酵菌丝中麦角甾醇的峰面积值分别为4 012 354、4 011 300、4 020 499；麦角甾酮的峰面积值分别为91 823、91 611、92 269，其平均含量分别为 0．59 mg·g－1、2．87 μg·g－1。

4 讨论

本试验采用HPLC双波长法对小柄马勃麦角甾醇和麦角甾酮的含量进行测定，结果显示2种成分在子实体和液体发酵菌丝中的色谱条件一致，单次进样供试品溶液，可分别在282 nm与349 nm处同时测定出麦角甾醇与麦角甾酮含量[12]，方法简便，稳定可靠，可作为小柄马勃子实体与液体发酵菌丝中2种化学成分的含量测定的方法。

麦角甾醇作为真菌类的特征甾醇，是真菌生物量的重要指标之一，与真菌生物量存在着相关关系。同时马勃的甾体类成分具有较强的生理活性，大量研究表明麦角甾醇抗炎效果显著，而麦角甾酮具有利尿、抗肿瘤、免疫抑制等多种药理功效[13－14]。所以利用HPLC双波长法测定小柄马勃中麦角甾醇与麦角甾酮的含量可为小柄马勃的质量评价提供参考依据。

比较小柄马勃子实体和液体发酵菌丝中麦角甾醇和麦角甾酮的含量，结果表明小柄马勃子实体中麦角甾酮含量较高，液体发酵菌丝中麦角甾醇含量较高。推测其原因，一方面子实体是由菌丝进一步生长分化而来，所以在小柄马勃不断生长成熟形成子实体，并释放孢子的过程中，不断地产生麦角甾酮或有甾体类成分转化为麦角甾酮，所以子实体中麦角甾酮含量要高于液体发酵菌丝。另一方面小柄马勃液体发酵的过程中，菌丝长势良好，分裂旺盛，而麦角甾醇又是其细胞膜的主要成分，所以麦角甾醇含量要高于传统药用部位子实体。因此在小柄马勃的医药开发过程中，我们可以根据实际需要选择不同的药用部位，同时也可以通过药理、药效学研究进一步考察液体发酵产物代替野生资源的可能性，以便更好地实现小柄马勃的开发与合理应用。