9型腺相关病毒经圆窗膜转导小鼠耳蜗两种方式的对比研究

齐景翠 祖勉 陈妮姗 郭维维 伊海金 杨仕明 余力生

1北京大学人民医院耳鼻咽喉科100044

2中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科，解放军总医院耳鼻咽喉研究所，聋病教育部重点实验室，聋病防治北京市重点实验室，军事声损伤防护实验室

3清华大学附属北京清华长庚医院耳鼻咽喉头颈外科

据WHO统计数据显示，全世界约有3.6亿人患有听力障碍，在题为“全球疾病负担”的名单中，听力障碍居于第15位(http://www.who.int/topics/global_burden_of_disease)。最近德国一项针对听力状况的流行病学调查显示听力障碍发病率为16%[1]，我国是听力障碍人数最多的国家，耳聋严重影响个人生理心理健康，同时给家庭和社会带来重大负担。

近年来，基因治疗为遗传性疾病的治疗带来新的希望，研究显示视网膜基因治疗以及AAV作为载体在人类是安全有效的[2]。Lalwani等[3]以豚鼠耳蜗为靶器官经圆窗注射目的基因开启了耳科领域的基因转导研究。随着研究进展，腺病毒、单纯疱疹病毒等病毒载体被用于内耳转导，腺相关病毒作为病毒载体具有其独特的优势，AAV可以通过特定的受体介导将转基因分子高效地转导入不同的细胞类型。AAVs可以有效地转染毛细胞以及介导入宿主基因组中，从而导致细胞内的转基因蛋白和表型变化的稳定、长期表达[4]。其介导的基因治疗在遗传性耳聋小鼠模型中证实听觉功能的恢复，具有良好的疗效、安全性和长期效果，特别是通过针对毛细胞[5]。小鼠模型是研究耳蜗基因转导的理想选择，很多人类耳聋相关基因突变已经被发现并且和小鼠的耳聋相关基因突变相匹配并在小鼠模型得到验证。本研究通过两种方式转导小鼠内耳携带GFP的9型腺相关病毒，比较两种方式的可行性、转染效率以及对听力的影响。为基因治疗在内耳进一步临床应用打下研究基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 携带无义序列的（pAV-U6-GFP）的重组9型腺相关病毒（ViGeneBiosciences），滴度3.90E13v.g./ml。

1.1.2 实验动物及分组健康SPF级4-5周龄C57BL/6J小鼠18只，雌雄不限，18-22g，购自维通利华公司，饲养于解放军总医院动物中心。应用CHISS软件随机分为两组，圆窗膜显微注射组9只，完整圆窗膜途径组9只，所有动物均采用左侧耳（手术耳）入路。（该实验方案通过解放军总医院动物伦理委员会批准）。

1.1.3 实验试剂4%PFA,10%EDTA,0.1MPBS缓冲液，鼠源性抗GFP抗体（1:200，天津三箭生物技术股份有限公司，KM8009），AlexaFluorence-488山羊抗鼠，小鼠解剖器械，Ideal Micro-drill，1ul、2ul微量进样器（注射器），微量注射泵,组织粘合剂等。

1.2 试验方法

1.2.1 听性脑干反应阈值检测

所有动物分别术前和术后两周行左耳ABR测听，采用美国TDT（型号MCO-18A20）测听仪器，Biosig32软件系统测定小鼠ABR阈值，详见[6]。1%戊巴比妥钠（0.1ml/10g,腹腔注射）进行麻醉满意后，置于隔声屏蔽室内，37°C保温袋保温，插入电极，直到波形检测不出，增加5dB SPL，记录到可重复的波形，即可标记为阈值。

1.2.2 手术方法

1.2.2.1 术前准备高压灭菌手术器械，洁净动物手术操作台，术前30分钟行紫外线消毒。左侧耳后备皮。

1.2.2.2 麻醉和手术

实验动物用1%戊巴比妥钠（0.1ml/10g,腹腔注射）进行麻醉，置于保温毯上，麻醉成功后，采用左耳耳后入路方式，头偏向右侧，碘伏消毒术区，铺无菌巾，解剖显微镜下，于左耳后沟中点约2mm处眼科剪切开皮肤，钝性分离皮下组织暴露耳后肌肉（胸锁乳突肌）[7]和面神经，钝性分离牵拉胸锁乳突肌，可见听泡后壁，分离表面覆着黏膜组织，于面神经出颅处微钻打孔，直径0.6-1mm，可见镫骨动脉和圆窗龛，圆窗膜显微注射组采用毛细吸管拉制玻璃电极，直径约10um，轻轻穿刺圆窗膜中心位置，可见淋巴液流出，无菌滤纸吸除液体，待稳定后，用直径约15um的玻璃电极连接微量注射器，置于微量泵上将1ulAAV显微注射入鼓阶（全程约5min）[8]，取脂肪组织封闭听泡，覆着明胶海绵，逐层缝合切口。完整圆窗膜途径组用1ul微量注射器将1ulAAV注入圆窗龛内[9]，观察5min，取小块脂肪组织封闭听泡，覆着明胶海绵，逐层缝合切口。

1.2.3耳蜗基底膜及冰冻切片制备及观察

文献报道[10]AAV在内耳的转染效率在转染后2周最高,且与转染后3月对比无显著差异。为观察两种方式AAV转染效率，选择术后两周行ABR测听后快速断头法处死动物，取出耳蜗，显微镊蜗尖处打孔，刺破圆窗膜和卵圆窗膜，常温下4%PFA灌流固定4h后，10%EDTA常温脱钙20h。将脱钙好的耳蜗组织放置0.1M的PBS缓冲液中，在解剖显微镜下剥离蜗壳、撕掉盖膜与前庭膜、切除血管纹及螺旋韧带，将基底膜从蜗轴上从顶转到底转抬离。将脱钙好的耳蜗组织脱水，OCT包埋，行冰冻切片。直接在激光共聚焦显微镜下观察（Leica TCS SP8）GFP表达情况。

1.2.4 免疫荧光染色

将制备好的基底膜或者切片组织置于0.25%的TritonX-100室温孵育30min，0.1M的PBS漂洗3次，每次5min，之后用10%山羊血清室温封闭30min，加一抗，鼠源性抗GFP抗体（1:200，天津三箭生物技术股份有限公司，KM8009）4°C孵育过夜，PBS漂洗3次，每次15min，加二抗AlexaFluorence-488山羊抗鼠(1:400,sigma,1605895)。室温孵育1h，PBS漂洗3次，每次20min，在载玻片上滴加一滴DAPI液，将基底膜放置DAPI液中，盖玻片封片。

1.2.5 激光共聚焦显微镜成像及计数

Leica TCS SP8选择488nm波长的激发光，对基底膜标本进行从上到下的扫描观察。为了统计AAV转染后GFP蛋白表达阳性细胞数，我们统计跨越200μm区域的毛细胞和支持细胞的总数。沿基底膜的整个耳蜗被分成三块长度相等的基底，中间和顶转[10]。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0统计学软件，数值以均数±标准差（）表示，各组间术后两周和术前ABR比较采用成组t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 术前和术后两周ABR阈值测试结果

术后两周圆窗膜显微注射组、完整圆窗膜途径组手术耳与术前ABR阈值差异均无显著统计学差异（表1、表2、图1）。

图1 圆窗膜显微注射组术前和术后两周术耳ABR、完整圆窗膜途径组术前和术后两周术耳ABR比较。Fig.1 Comparison of auditory brainstem response(ABR)threshold across groups,pre-operation of microinjection group(PO-MJ),two weeks post operation of microinjection group(TWPO-MJ),pre-operationofintactRWM group(PO-IR),two weeks post operation of intact RWM group(TWPO-IR).

表1 圆窗膜显微注射组动物术后两周和术前术耳ABR阈值（±s，dB SPL）Table 1 ABR threshold of microinjection group at two weeks post operation and pre-operation

表1 圆窗膜显微注射组动物术后两周和术前术耳ABR阈值（±s，dB SPL）Table 1 ABR threshold of microinjection group at two weeks post operation and pre-operation

CLICK 4K 8K 12K 24K 38.89±4.17 41.11±8.94 29.44±6.35 20.00±3.54 45.56±8.08 41.11±7.41 41.67±11.99 36.11±8.94 24.44±9.50 47.22±10.95 0.84 0.14 2.07 1.74 0.46 0.43 0.89 0.07 0.12 0.66

表2 完整圆窗膜途径组动物术后两周和术前术耳ABR阈值（±s，dB SPL）Table 2 ABR threshold of intact RWM group at two weeks post operation and pre-operation

表2 完整圆窗膜途径组动物术后两周和术前术耳ABR阈值（±s，dB SPL）Table 2 ABR threshold of intact RWM group at two weeks post operation and pre-operation

CLICK 4K 8K 12K 24K 38.89±4.86 43.33±5.00 31.67±7.07 20.56±6.82 41.11±8.21 36.67±5.59 42.22±7.55 31.67±8.66 23.33±7.07 43.89±7.82 0.80 0.39 0.00 0.76 0.81 0.45 0.70 1.00 0.47 0.44

2.2 术后两周耳蜗解剖肉眼观察

术后两周两组术后耳蜗中耳腔、内耳无渗液、出血情况，与对侧耳比较无明显差异。圆窗膜完整，圆窗龛无炎性渗出物。

2.3 内耳GFP表达情况

激光共聚焦显微镜下观察，圆窗膜显微注射组内毛细胞呈现明亮的自发绿色荧光(图A-F)，底转较强，且只在内毛细胞有表达，每200μm区域GFP阳性细胞底转为（25.6±1.85，n=5），中转为（16.6±1.85，n=5），顶转为（3.8 ±1.67，n=5）。完整圆窗膜途径组及对侧耳无自发绿色荧光，GFP抗体复染后仍观察不到绿色荧光（图E、F）。9型AAV病毒难以透过完整的圆窗膜转染内耳，和Mhatre等研究结果一致[11]。DAPI核染观察均未见内毛细胞缺失情况。

图2 9型AAV在圆窗膜显微注射组耳蜗内毛细胞选择性表达（A-F），箭头所指为转染阳性的内毛细胞(A图为底转基底膜GFP自发荧光、B图为A和DAPI核染后叠加、C图为中转基底膜GFP自发荧光、D图为顶转基底膜GFP自发荧光、E和F图为耳蜗切片不同层面GFP自发荧光);完整圆窗膜途径组及对侧耳无自发绿色荧光，GFP抗体复染后仍观察不到绿色荧光（图G、H）A-H x20.Fig.2 Transduced IHCs throughout the cochlea in adult mice of microinjection group and intact RWM group，the arrow points to transfected positive hair cells.

3 讨论

耳蜗位于颞骨深部以及血迷路屏障的存在，目前内耳仍无有效局部用药方式和途径，无论是药物治疗还是基因导入，选择合适的导入途径是耳聋治疗的重要基础。本实验通过比较显微注射圆窗膜及透过完整圆窗膜两种方式AAV转染内耳的情况，对其可行性、转染效率以及对听力的影响进行研究，为基因治疗和内耳转导在临床应用打下研究基础。

我们在实验中观察到9型AAV病毒难以通过完整的圆窗膜，圆窗膜作为中耳和内耳的屏障发挥着重要作用，文献报道AAV感染宿主细胞需要特定的受体[12-13]，可能由于圆窗膜上缺乏AAV病毒特定受体介导而被阻隔。显微注射刺破圆窗膜可观察到9型AAV转染内毛细胞，且底转转染效率最高可达到100%，从底转到顶转转染效率逐渐下降。9型AAV特异性转染内毛细胞，而不转导外毛细胞，这和YI Laishu[10]研究结果相符，但本研究并未观察到支持细胞有自发荧光表达，9型AAV可作为特异性干扰或者上调内毛细胞中蛋白和基因的靶向性载体。

研究中两种方式均未引起小鼠耳蜗ABR阈值显著性改变（P＞0.05，详见表1、表2），耳后入路听泡后壁打孔手术操作创伤小，对耳蜗正常结构和生理功能影响较小，这与陈伟等[9]报道的在豚鼠耳蜗的操作一致。本研究中采用直径约10-15um的玻璃电极显微刺破圆窗膜，可见到淋巴液流出，待流出稳定后注射AAV，后取肌肉组织滴加组织粘合剂封闭圆窗龛，并未引起ABR阈值大幅度上调，术后两周ABR阈值较术前有上移，阈移在10dB以内，差异无显著统计学意义。可能的原因有：手术操作小心，术中无大量出血情况，手术操作时程控制在30min内；显微微量电极注射针头直径小（10-15um），对圆窗膜造成的创伤小；早期淋巴液外流诱导的淋巴管周围容积在耳的固定容积内的变化导致静水压力改变从而使耳蜗导水管驱动代偿性容积变化[14-15]，得到脑脊液的及时补偿作用；注射过程持续5min，减少液体进入鼓阶对基底膜的冲击作用；组织粘合剂将肌肉组织封闭圆窗龛，有助于减少外淋巴液进一步持续外流；注射AAV量为1ul[8]，超过1ul增加听力损失风险。对侧耳蜗是否被转染不能确定，本实验未观察到AAV转染对侧耳蜗，在AV转染豚鼠耳蜗的文献[16]中报道增加病毒用量可以观察到对侧耳蜗转染的情况，耳蜗导水管-脑脊液循环到对侧耳为其可能的原因。增加AAV用量会增加听力受损的风险，在以后的研究中可以尝试在其它大型动物如小型猪等增加AAV用量，观察是否能进入对侧耳，为单侧基因导入治疗双侧耳聋打下基础。

本研究的不足之处，只研究了9型AAV对内耳的转染情况，其它亚型有待进一步研究，特别是克服了人中和抗体影响的新血清型AAV载体（bAAV）[17]；由于顶转转染效率较低，尚需进一步尝试新的手术入路，以寻求更高的转染效率，如半规管入路[18]等，国内尚未有相关文献报道。由于小鼠听觉发育成熟较晚，解剖结构和人类相差较大，小型猪是实验动物中除灵长类外和人类进化关系最近的物种，与人类在内耳各器官的解剖结构相似，小型猪作为耳科领域的新兴动物模型将为耳科学及听力学的相关研究，为人类聋病的防治提供最理想的实验模型及论证[19-20]，因此，在小型猪等大动物模型上进一步验证该手术入路对耳蜗的转染效率以及对听力的影响是进一步研究的方向。