隐性听力损失动物模型建立与防护的研究

2018-09-22 10:02戚国伟刘宸箐徐增志刘晨陈立伟李欢胡一勇方舒郭维维于宁杨仕明
中华耳科学杂志 2018年4期
关键词:纯音豚鼠动物模型

戚国伟 刘宸箐 徐增志 刘晨 陈立伟 李欢 胡一勇 方舒 郭维维 于宁 杨仕明

1解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科,解放军耳鼻喉研究所,聋病教育部重点实验室(北京100853)

2解放军医学院(北京100853)3解放军总医院医学美术室(北京100853)

隐性听力损失(Hidden Hearing Loss,HHL)的概念由Liberman于2015年首次提出[1]。患有隐性听力损失这类疾病的患者,纯音测听结果正常,但在处理复杂言语信息及时域编码功能方面的能力缺失,尤其是在嘈杂环境中更加明显,即表现为噪声环境下的言语识别率下降。这种常规检查手段无法检出的、由听神经损伤所引起的阈上听觉感知缺失性疾病,叫做隐性听力损失。目前关于隐性听力损失的研究主要集中于两个方面:一是发病机制的研究[2-3],另一方面是临床诊断方法的研究[4]。这其中,关于隐性听力损失动物模型建立的研究更加有限,且不同课题组所用噪声声源、强度及暴露时间等条件均存在一定差异,尚未形成公认、可靠的动物模型建立标准。另外,几乎所有文献报道的噪声均为稳态噪声。为模拟枪械、火炮射击等所引起噪声损伤,本文采用脉冲噪声暴露豚鼠,摸索建立隐性听力损失动物模型的噪声条件及损伤机制。同时,实验中还利用吸入氢气的方法对动物进行噪声暴露前的预处理,为研究隐性听力损失防护提供直接的实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

选取SPF级健康白色红目、耳廓反射灵敏、无噪声接触史的豚鼠16只,体重250-300g,雌雄不限,购自北京金牧洋实验动物有限公司。正常豚鼠听性脑干诱发电位(Auditory Brainstem Response,ABR)阈值为18.82±4.52 dB SPL[5],参照此标准,实验前对所有豚鼠进行ABR阈值测定,确保听力正常。所有豚鼠均饲养在环境为恒温(20-26℃)、恒湿(45%-50%)条件下的超净层流架中,使用Norsonic 140型声级计监测环境噪声,确保环境噪声维持在40dB SPL以下。

实验动物随机分为4组,分别为:空白组(A组)3只、脉冲噪声暴露30次组(B组)3只、脉冲噪声暴露15次组(C组)5只、氢气预防+脉冲噪声暴露15次组(D组)5只,设置两个ABR测听记录点:脉冲噪声暴露前、脉冲噪声暴露后1天(P1)。所有实验操作均得到中国人民解放军总医院动物伦理委员会批准。

1.2 脉冲噪声暴露

将清醒状态的豚鼠放置于特制的笼内,将其头部固定于正中,且脉冲噪声暴露过程中不会转动,确保双耳同等的接受脉冲噪声刺激。在专用的消声室自由声场中,将特制的脉冲噪声激发装置置于动物头部前方水平位,距离豚鼠双耳耳廓前缘约5cm(见图1-A)。给予压力峰值为163 dB SPL,脉宽为0.25ms,间隔时间为6.5s的脉冲噪声,分别连续暴露30次及15次。为排除脉冲噪声装置自身物理特性改变所导致的实验误差,在每次噪声暴露前均使用Norsonic 140型声级计对装置进行校准。

1.3 豚鼠听性脑干反应(ABR)测定

动物麻醉:豚鼠使用1%戊巴比妥钠(0.4ml/100g)腹腔注射进行麻醉。完全麻醉后,待其呼吸及心跳平稳,检查清理双侧外耳道耵聍,并将动物置于保温毯上。

ABR测定:采用美国TDT测听设备和Biosig测听分析软件,在隔声屏蔽室内进行测听。使用银针电极测试,记录电极安置于豚鼠颅顶双耳耳廓前缘连线中点处,参考电极置于测试耳耳垂下方,接地电极置于对侧耳耳垂下方。测试耳机置于外耳道口约0.5cm,方向与外耳道走行方向平行,并确保未与毛发、耳廓等相接触。刺激声为短声(click),带通滤波宽度为300-3000Hz,平均叠加次数1024次,刺激持续时程为10ms,最大刺激声强度为90 dB SPL,每次降低幅值为10 dB SPL,直至无法引出可重复的ABR波形,再以5 dB幅度提高刺激声强度,直至能引出可重复的ABR波形,并重复3次,其中至少有2次可引出确定的波形,此刺激声强度即为动物的听阈[6]。再以短纯音(Tone Burst)16 kHz为刺激声,刺激持续时间为4ms,上升和下降时间为0.5ms。

1.4 氢气预防性治疗

D组于脉冲噪声暴露前2小时给予氢气预防性治疗,氢气源由Healthgen AMS-H-01设备产生,通过自制的密封管路,将干燥后的氢气导入特制容器中,待容器内氢气浓度稳定在1000ppm后,将豚鼠放入容器内,持续吸入一小时,而后取出动物,一小时后进行脉冲噪声暴露(豚鼠吸入氢气的密封装置见图1-B)。

1.5 统计分析

所有实验数据以均数±标准差()表示,实验数据采用SPSS 22.0统计软件包进行分析。先对数据进行正态性检验,为消除混杂因素对结果的影响,不同剂量脉冲噪声暴露前后脑干诱发电位短声阈值、短纯音(16 kHz 70 dB SPL)Ⅰ波潜伏期、幅值进行比较利用自身配对t检验,脉冲噪声暴露15次组与氢气预防组采用两两配对t检验,P<0.05具有显著统计学差异。

2 结果

2.1 脉冲噪声暴露前豚鼠听力学指标

健康豚鼠ABR阈值测定结果曲线图中包括5个典型的波峰,所用豚鼠ABR短声阈值平均为21.33±3.20 dB SPL;短纯音(Tone Burst,16kHz 70 dB SPL)声强刺激下,其Ⅰ波潜伏期平均为1.57±0.1ms;幅值平均为0.46±0.08uv。Tone Burst(16 kHz 70 dB SPL)声强刺激反应波形如图1-C所示。

图1 豚鼠听性脑干反应(ABR)测定Fig.1 The auditory brainstem response of guinea pig(A)应用脉冲噪声暴露装置对豚鼠进行造模;(B)豚鼠吸入氢气的密封装置;(C)正常豚鼠Tone Burst 16kHz波形曲线(A)Guinea pig model of hidden hearing loss using a pulse electric spark detonation meter(B)Sealing device of inhaling hydrogen for guinea pig(C)ABR-Tone Burst 16kHz waves of healthy guinea pig

2.2 不同剂量脉冲噪声暴露后豚鼠ABR短声阈值变化情况

不同剂量的脉冲噪声暴露1天后,B、C、D三组所有豚鼠的阈值均有不同程度的提升,与暴露前的阈值比较后,P值均小于0.05(各组脉冲噪声暴露前后ABR阈值比较的统计量t值及P值见表一),表明三组豚鼠都产生了不同程度的听力损失。其中脉冲噪声暴露30次组的阈值平均提高36.67dB,暴露15次组的阈值平均提高21.25dB,氢气预防加暴露15次组的阈值平均提高10.5dB(各组ABR阈值变化趋势见图2-A)。可以看出,脉冲噪声暴露次数越多,阈值提升越明显。

2.3 不同剂量脉冲噪声暴露后豚鼠高频反应Ⅰ波潜伏期、幅值变化情况

为了研究低剂量脉冲噪声暴露是否能够诱发豚鼠产生隐性听力损失,我们特别测定了豚鼠高频听力的部分特定指标。结果显示,不同剂量脉冲噪声暴露后,各组豚鼠短纯音(16kHz 70dB SPL)Ⅰ波潜伏期都有不同程度的延长。脉冲噪声暴露前后自身对照的统计分析结果显示,30次组(B组)的P值为0.61,变化不具有统计学意义;15次组(C、D组)的P值均小于0.05,前后变化具有统计学意义(各组脉冲噪声暴露前后短纯音Ⅰ波潜伏期比较的统计量t值及P值见表二)。相较于脉冲噪声暴露30次,15次组的高频反应Ⅰ波潜伏期均有所延长(各组脉冲噪声暴露前后高频反应Ⅰ波潜伏期变化趋势见图2-B)。

进一步分析低剂量脉冲噪声暴露前后豚鼠短纯音Ⅰ波幅值变化情况可见,不同剂量脉冲噪声暴露后,各组豚鼠Ⅰ波幅值均有不同程度的降低。脉冲噪声暴露前后自身对照的统计分析结果显示,三组P值均小于0.05,表明各组变化均具有统计学意义(各组脉冲噪声暴露前后短纯音Ⅰ波幅值比较的统计量t值及P值见表三)。各组间对比可见,脉冲噪声暴露15次组的幅值变化最为显著。(各组脉冲噪声暴露前后高频反应Ⅰ波幅值变化趋势见图2-C)

2.4 氢气防护作用在低强度脉冲噪声暴露后的听力学指标变化对比

在摸索建立隐性听力损失豚鼠动物模型的条件过程中,我们额外添加了氢气预处理因素,以期观察氢气对隐性听力损失的预防作用。通过C、D两组脉冲噪声暴露后的听力学指标统计分析,我们发现在脉冲噪声暴露前吸入氢气,其ABR的click阈值、短纯音Ⅰ波幅值的P值都小于0.05,改变具有统计学意义;短纯音(16kHz 70dB SPL)Ⅰ波潜伏期的P值为0.26,改变不具有统计学意义(C、D组各项听力学指标比较的统计量t值及P值见表四)。

图2 噪声暴露前后各组豚鼠ABR指标变化趋势Fig.1 Trends of guinea pig ABR result before and after impulse noise exposure

3 讨论

目前针对隐性听力损失的致病机制研究主要集中于两个方面,一个是噪声所引起的神经突触病变[2];一个是暂时性听神经纤维脱髓鞘病变[3]。当前研究这两种致病机制的动物模型主要应用豚鼠及小鼠展开,用于造模的噪声源也都是稳态噪声。应用脉冲噪声作为噪声源建立动物模型的研究报道较少,而将其应用于隐性听力损失的研究中尚属首次。当前,小型猪作为动物模型的基础及临床研究在耳科学界被广泛应用[7]。侯琨[8]等利用宽频带白噪声(120dB SPL)对小型猪和豚鼠进行单次3小时的暴露后发现,同噪声暴露后即刻相比,豚鼠在噪声暴露后24小时其ABR阈值就有明显差异,由噪声暴露所引起的听力损失得到显著恢复,7天后其阈值同暴露前相比无明显统计学差异。相比之下,小型猪对噪声更加敏感,噪声暴露7天后其阈值同暴露前相比仍然存在明显统计学差异,且耳蜗扫描电镜下毛细胞形态学观察也发现了更多的纤毛结构异常,相较小型猪,豚鼠对噪声耐受力更强,且恢复更快。陈志婷[9]等利用听性脑干反应分析观察不同剂量脉冲噪声暴露后小型猪的听力变化发现,脉冲噪声暴露30次、8周之后,小型猪的ABR阈值在各频率上仍然存在不可逆的提升。因此,对于应用低剂量脉冲噪声制作隐性听力损失动物模型而言,豚鼠相较小型猪具有明显优势。

本实验利用低强度脉冲噪声暴露豚鼠进行隐性听力损失的动物模型建立,通过暴露1天后的ABR阈值测定可见,30次及15次脉冲噪声暴露的豚鼠阈值分别存在36.67dB和21.25dB的提升。Edward Lobarinas[10]等在动物实验中发现,噪声暴露24小时后ABR阈值产生约30dB暂时性域移(Temporary Threshold Shift,TTS)的大鼠,其毛细胞完整但突触结构发生破坏,即发生隐性听力损失。除此之外,所有隐性听力损失大鼠的听力学检测结果还有一个共同特点:阈上刺激的ABRⅠ波幅值降低,且不可逆转,这点可用于判断实验动物存在隐性听力损失。

本实验在测定ABR click阈值的同时,还进行了ABR(Tone Burst 16kHz 70dB SPL)Ⅰ波幅值、潜伏期的测定。相较于短音,短纯音具有更好的频率特异性,可以更加准确评估实验动物某一特定频率的听力水平。Liberman[4]等人在研究隐性听力损失诊断方法的实验中发现,隐性听力损失高危组人群的超高频(8-20kHz)听阈较正常组明显提升,提示隐性听力损失对高频听力存在较大影响,故本实验中短纯音选择了16kHz作为刺激声频率。与此同时,豚鼠的听性脑干反应中,其反应波波峰幅值、潜伏期与刺激声强存在特殊的变化关系。当声强在20-70dB范围内提升时,其刺激波幅值提升较快,潜伏期缩短也较快;当刺激声在80-90dB范围内提升时,其刺激波幅值及潜伏期变化明显变小,呈现出非线性关系,70dB为临界值[5]。故本实验短纯音的刺激声强选择70dB。通过测试,我们观察到正常豚鼠的ABR(Tone Burst 16kHz)Ⅰ波潜伏期为1.57±0.1ms,幅值为0.46±0.08uv。经过30及15次的脉冲噪声暴露24h后,其潜伏期较脉冲噪声暴露前分别产生了0.02ms和0.25ms的延长,其幅值较脉冲噪声暴露前分别产生了0.14uv和0.19uv的降低。通过与脉冲噪声暴露前的数据对比发现,C组(15次)的潜伏期和阈值都产生了具有统计学意义的变化。ABRⅠ波幅值代表螺旋神经元的总和电位活动[3],通过幅值变化可以反映出螺旋神经元的结构与功能完整性。ABRⅠ波潜伏期同耳蜗内毛细胞与I型螺旋神经元之间形成的带状突触功能有关,潜伏期的延长同带状突触结构破坏密切相关。据此,根据脉冲噪声暴露前后听力学指标的变化,可以认定脉冲噪声暴露15次后的豚鼠存在隐性听力损失。

表1 脉冲噪声暴露前后各组豚鼠ABR click阈值比较(±s,A、B组n=6,C、D组n=10,dB SPL,t检验)Table 1 Statistical analysis ofABR thresholds of guinea pig before and 24h after impulse noise exposure(±s,GroupAand Group B n=6,Group C and Group D n=10,dB SPL,t test

表1 脉冲噪声暴露前后各组豚鼠ABR click阈值比较(±s,A、B组n=6,C、D组n=10,dB SPL,t检验)Table 1 Statistical analysis ofABR thresholds of guinea pig before and 24h after impulse noise exposure(±s,GroupAand Group B n=6,Group C and Group D n=10,dB SPL,t test

P<0.05 means statistic difference

before noise 1 day later t p 21.33±3.20 NA NA NA 23.33±4.08 60±5.48 10.26<0.001 19.38±1.77 40.63±5.63 10.32<0.001 20.50±2.84 31.00±2.11 11.70<0.001

表2 脉冲噪声暴露前后各组豚鼠ABR Tone Burst 16kHzⅠ波潜伏期比较(±s,A、B组n=6,C、D组n=10,ms,t检验)Table 2 Statistical analysis ofABR Tone Burst 16kHzwaveⅠlatency of guinea pig before and 24h after impulse noise exposure(±s,GroupAand Group B n=6,Group C and Group D n=10,ms,t test)

表2 脉冲噪声暴露前后各组豚鼠ABR Tone Burst 16kHzⅠ波潜伏期比较(±s,A、B组n=6,C、D组n=10,ms,t检验)Table 2 Statistical analysis ofABR Tone Burst 16kHzwaveⅠlatency of guinea pig before and 24h after impulse noise exposure(±s,GroupAand Group B n=6,Group C and Group D n=10,ms,t test)

P<0.05 means statistic difference

A B C D before noise 1 day later t p 1.57±0.1 NA NA NA 1.62±0.05 1.64±0.05 0.55 0.61 1.53±0.05 1.78±0.09 10.88<0.001 1.55±0.13 1.73±0.15 2.64 0.03

表3 脉冲噪声暴露前后各组豚鼠ABR Tone Burst 16kHzⅠ波幅值比较(±s,A、B组n=6,C、D组n=10,uv,t检验)Table 3 Statistical analysis ofABR Tone Burst 16kHz waveⅠamplitude of guinea pig before and 24h after impulse noise exposure(±s,GroupAand Group B n=6,Group C and Group D n=10,uv,t test)

表3 脉冲噪声暴露前后各组豚鼠ABR Tone Burst 16kHzⅠ波幅值比较(±s,A、B组n=6,C、D组n=10,uv,t检验)Table 3 Statistical analysis ofABR Tone Burst 16kHz waveⅠamplitude of guinea pig before and 24h after impulse noise exposure(±s,GroupAand Group B n=6,Group C and Group D n=10,uv,t test)

P<0.05 means statistic difference

A B C D before noise 1 day later t p 0.46±0.08 NA NA NA 0.45±0.13 0.31±0.07-2.70 0.043 0.47±0.1 0.28±0.1-4.20 0.004 0.47±0.05 0.39±0.1-2.67 0.026

表4 吸入氢气对豚鼠低剂量脉冲噪声暴露防护效果的听力学指标比较(±s,n=10,t检验)Table 4 Statistical analysis of auditory results of hydrogen on the protective effect of impulse noise exposure in guinea pig(±s,n=10,t test)

表4 吸入氢气对豚鼠低剂量脉冲噪声暴露防护效果的听力学指标比较(±s,n=10,t检验)Table 4 Statistical analysis of auditory results of hydrogen on the protective effect of impulse noise exposure in guinea pig(±s,n=10,t test)

P<0.05 means statistic difference

Group C Group D t p Click阈值40.63±5.63 31.00±2.11 5.35 0.001 TB16kⅠ波潜伏期1.78±0.09 1.73±0.15 1.23 0.26 TB16kⅠ波幅值0.28±0.1 0.39±0.1-2.53 0.039

在研究脉冲噪声暴露次数与隐性听力损失之间关系的同时,我们特别设定一组实验动物(D组),在脉冲噪声暴露1小时前给予预防性氢气吸入,以观察氢气对脉冲噪声所致隐性听力损失是否存在预防作用。通过对比C、D两组脉冲噪声暴露后的听力学数据发现,氢气预处理组的豚鼠脉冲噪声暴露24小时后其click阈值及Ⅰ波幅值较C组差异具有统计学意义。氢气预处理组豚鼠脉冲噪声暴露前后自身对照结果显示,其听力学指标也产生了具有统计学意义的差异,阈上刺激ABR的Ⅰ波幅值显著下降,这与以往报道一致[11-14]。相较C组可以认为。D组豚鼠脉冲噪声暴露后也产生了隐性听力损失,且在听力学表现方面吸入氢气对隐性听力损失存在防护作用。

本研究首次将脉冲噪声运用到隐性听力损失动物模型研究当中,通过对比不同次数脉冲噪声暴露后豚鼠的听力学指标变化,初步建立了脉冲噪声暴露致豚鼠隐性听力损失的动物模型。同时,利用吸入氢气的方法对豚鼠进行噪声暴露前的预处理,对氢气在隐性听力损失中的预防作用进行了初步探索,其相关分子机制及病理学变化需要进一步研究。

猜你喜欢
纯音豚鼠动物模型
自动纯音听阈检测技术
胃癌前病变动物模型复制实验进展
湿热证动物模型造模方法及评价研究
溃疡性结肠炎动物模型研究进展
ABR、40Hz-AERP和ASSR与主观纯音听阈测定的相关性研究
健听青年短纯音ABR测试结果分析
高压氧综合治疗高频下降型突发性聋疗效分析
做瑜伽的小豚鼠
玩具产品供求
豚鼠奥运会