Pigm特异性选择标记的开发及其在粳稻穗颈瘟抗性育种中的利用

曾生元 李闯 杜灿灿 孙立亭 景德道 林添资 余波 钱华飞 姚维成 周义文 龚红兵



特异性选择标记的开发及其在粳稻穗颈瘟抗性育种中的利用

曾生元 李闯 杜灿灿 孙立亭 景德道 林添资 余波 钱华飞 姚维成 周义文 龚红兵*

(江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，江苏 句容 212400；*通讯联系人，E-mail: 1179809265@qq.com)

【目的】是一个广谱的稻瘟病抗性基因，源自持久抗性品种谷梅4号，与、、、和等互为复等位基因但抗谱存在差异。为了更好地在分子辅助选择育种中利用基因开发与特异性标记具有重要意义。【方法】在已有文献报道定位结果的基础上，通过随机测序获得了一段谷梅4号基因组的特异序列，并据此开发了一组用于筛选基因的分子标记，进一步选取江淮稻区3个不同生态型代表性粳稻品种作为受体，利用分子标记辅助选择结合对抗性基因的背景检测将基因导入受体品种。【结果】Pigm-4标记位于基因簇内部，与抗病功能元件紧密连锁，对不同类型的品种检测发现该标记特异性强，且利用该标记可将与、、、以及区分开来。对受体亲本稻瘟病抗性基因的检测和接种结果分析发现江淮稻区粳稻品种虽然携带了、、、中的2~3个基因，但是对强毒力的稻瘟病小种抗性普遍不强，而3种代表性粳稻背景下导入基因均可显著提高其对穗颈瘟的抗性水平。【结论】可以作为抗稻瘟病粳稻育种的有利基因资源加以利用，而Pigm-4是分子标记辅助筛选的优异标记。

；特异分子标记；粳稻；穗颈瘟；抗性

水稻的全生育期均有可能受稻瘟病为害，但是穗(颈)瘟直接导致水稻减产且无法补救，对水稻的为害更为严重[1-2]。大多广谱稻瘟病抗性资源来自籼稻或者野生稻，而粳稻中普遍缺乏抗稻瘟病优异种质(国家水稻数据中心，http://www.ricedata.cn /gene/gene_pi.htm)。气候条件适宜时，粳稻极易暴发稻瘟病。例如，2014年和2015年江淮稻区的大多粳稻品种均受不同程度穗颈瘟为害[3]。

培育抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的手段。传统的水稻稻瘟病抗性育种是通过抗性鉴定(一般采用接种或发病区鉴定等方式)对植株进行表型选择，工作量大，耗费时间长，且易受环境条件的限制，鉴定结果的误差较大，选择效率较低。通过分子标记辅助选择抗病基因则可有效减少上述不利因素，是培育抗病品种的有效途径之一[4]。但是，由于稻瘟病菌具有高度多样性、变异性的特点，一些抗谱窄的抗性基因则易在较短时间内丧失抗性。因此，聚合抗谱广、抗性持久的抗病基因选育抗病品种，是抗稻瘟病育种的关键策略[5]。

是从持久抗稻瘟病品种谷梅4号中鉴定到的一个广谱抗稻瘟病基因(簇)，与、、、、和等基因位于同一基因家族或互为复等位基因，但不同基因间的抗谱差异明显[6-11]。江苏、安徽、湖北、广东、海南等不同地区稻瘟病代表性小种接种鉴定结果表明，基因对以上稻瘟病生理小种的抗性频率最高可达91.9%，抗谱在75%左右，的抗谱较、、更广，且粳稻中几乎不存在基因[12-13]。由于与等基因(在粳稻中有一定比例的分布)位于同一基因簇，要实现对的利用就需要将与等其他不同复等位基因区分开来，从而将特异地导入至受体品种之中。目前用于检测基因的常用标记包括功能标记M26205、M80362以及InDe1标记S29742等[10, 14-17]。但是，M26205是显性标记，不能区分纯合与杂合。

本研究通过短序列测定，获得了谷梅4号基因组的一段特异序列，并据此成功开发了谷梅4号基因组特异的分子标记，进一步通过对背景抗性基因的筛选、分子标记辅助选择结合田间选育，将导入携带不同抗稻瘟病基因的不同类型粳稻品种之中，探讨了在培育抗稻穗颈瘟粳稻新品系中的利用价值。

1 材料与方法

1.1 水稻材料

本研究所用的水稻材料包括、、、、及的供体品种75-1-127、C101A51、Toride 1、Fukunishiki、IR65482及谷梅4号；受体品种武运2674(迟熟中粳稻)、武运粳27(中熟中粳稻)、镇稻18(早熟晚粳稻)和籼、粳、籼粳中间型及其他类型代表性品种271份。其中，、、、、的供体品种由江苏省里下河地区扬州农业科学研究所提供，谷梅4号引自中国水稻研究所；用于特异性检测的271份品种材料由扬州大学严长杰教授课题组提供。

1.2 引物设计与序列测定

根据Deng等[6]的定位结果，在http://www.ncbi. nlm.nih.gov/网站上获取水稻品种日本晴第6染色体10 360 000―10 440 000 bp序列，利用软件Primer 5.0软件，设计10对预计产物在500~1200 bp的扩增标记(表2)，这些标记均匀分布，间隔10 kb左右。分别以谷梅4号和日本晴、9311为模板扩增，产物测序，再根据序列比对结果开发特异性分子标记。

1.3 DNA提取、PCR扩增及电泳分析

用设计开发的Pigm-4标记对271份水稻代表性品种进行多态性检测，采用SDS法提取水稻叶片的DNA。

参照龚红兵等[18]的方法进行PCR，反应总体积为10 μL，包括DNA 1.5 μL，2 mmol/L上下游引物各0.5 μL，10×缓冲液(GENERAY) 1.2 μL, 12 mmol/L dNTP 0.3 μL，1000 UDNA聚合酶(GENERAY) 0.1 μL，加ddH2O补足至10 μL。PCR扩增条件为94℃下预变性5 min；94℃下变性30 s，55℃~60℃退火30 s(温度因引物不同而异)，72℃下延伸30 s左右(根据预期产物长度，按1 kb/min调整延伸时间)，扩增32个循环；72℃下延伸5 min，4℃下保温。产物经8%垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳，0.1%硝酸银染色后观测。

1.4 水稻穗颈瘟抗性鉴定与评价

水稻穗颈瘟抗性鉴定试验于镇江市农业科学研究所行香基地进行。5月20日播种，于6月20日移栽，单本栽插，每区5行，每行12株，株行距13.3 cm×25.0 cm。2次重复，常规水肥管理。

于水稻孕穗期，选用分别来自广东省、湖北省、海南省、浙江省和江苏省的致病频率较高的5个代表性菌株GD18-3(B1，致病频率65.6%)、ES9-5-1(B15，致病频率75.0%)和HN1.1(C1，致病频率59.4％)、ZJ13-4(A15，致病频率63.3％)和XH8.4.4(G1，致病频率37.5％)接种。这5个菌株均引自扬州市农业科学研究所。扩大培养后等比例混合这5个菌株的孢子液。分别选择每个株系的第2行，用注射器将接种液缓缓注入稻苞内，每穗注射1 mL，每重复接种10穗，并对接种的稻穗作好标记。参照国际水稻研究所分级标准(IRRI, 2002)调查穗颈瘟抗性级别[19]。

表1 代表性品种在Pigm-4座位的带型

Table 1. Typical varieties and their genotype in Pigm-4 locus.

1.5 受体亲本稻瘟病抗性背景分析

对武运2674、武运粳27、镇稻18等3个受体亲本进行稻瘟病抗性基因的检测，检测的基因包括、、、、、、、、，其中，、、、、、的特异性检测标记引自Wu等[12]，的特异性标记引自华丽霞等[20]，的特异性标记引自Costanzo等[5]，的特异性标记引自孙立亭等[21]。这些标记的具体信息列于表3。

表2 本研究用于测序和检测Pigm基因的相关标记

表3 检测抗稻瘟病基因的引物信息

1.6 导入系材料的构建与Pigm基因的效应分析

从2014年正季开始，以武运2674与谷梅4号杂交、回交；2014年冬季以武运粳27、镇稻18为母本，与谷梅4号杂交，之后连续回交，回交后代均利用Pigm-4标记配合使用Pigm-2标记检测，至2017年正季，分别回交至BC5F1、BC4F1代，对部分目标单株、株系进行接种和病圃鉴定。

2 结果与分析

2.1 特异连锁标记的获得与验证

对10对随机引物的测序结果分析表明在第4对产物中谷梅4号的DNA序列与粳稻日本晴相比，谷梅4号缺失73 bp，而与9311相比缺失了44 bp(图1)。根据此差异，我们设计了InDel标记Pigm-4(表2)。

根据测序结果比对差异，我们在上游获得了一段籼粳特异序列差异，并据此设计了InDel标记Pigm-2(表1)。

进一步利用Sepigm-4标记分别对携带、、、-、的供体品种75-1-127、C101A51、Toride1、Fukunishiki、IR65482进行扩增，测序比对发现各亲本序列均与谷梅4号不同(图1)。通过Pigm-4标记检测不同类型的271份代表性品种，其中仅一份未知来源的籼稻材料可扩增出与谷梅4号一致的带型，从而说明Pigm-4具有很强的特异性(表1、图2)。

图1 谷梅4号序列与相关亲本的部分序列比对结果

Fig. 1. Sequence alignment of differentalleles amplified with Sepigm-4.

表4 3个受体亲本所包含的抗稻瘟病基因型及抗性等级

+: 表示携带目标基因; -：不携带目标基因；HS―高感; S―中感。

+, With target gene; -, Without target gene; HS, High sensibility; MS, Medium sensibility.

A图1~18泳道分别为亲本谷梅4号、IR65482、C101A51、75-1-127、Toride 1、Fukunishiki、武运2674/谷梅4号BC3F3纯系、9311、镇恢82、镇恢832、成恢177、成恢727、秀水519、武运2674、武运粳27、镇稻88、镇稻18及镇糯19；B图1、2泳道分别为武运2674、谷梅4号，3~18泳道为武运2674/谷梅4号部分BC3F2单株。

In Fig. A, Lanes 1 to 18 represent Gumei 4, IR65482, C101A51, 75-1-127, Toride 1, Fukunishiki, BC3F3homozygous lines of Wuyun 2674/Gumei 4, 9311, Zhenhui 82, Zhenhui 832, Chenghui 177, Chenghui 727, Xiushui 519, Wuyun 2674, Wuyunjing 27, Zhendao 88, Zhendao 18, and Zhennuo 19, repectively.

In Fig. B, 1, Wuyun 2674; 2, Gumei 4; Lanes 3 to 18 represent some BC3F2individuals derived from Wuyun 2674/ Gumei 4.

图2 Pigm-4在部分亲本间(A)及分离群体(B)的检测结果

Fig. 2. Diversity detection of Pigm-4 marker in relevant parents and segregation population.

2.2 受体亲本的稻瘟病抗性基因

利用特异性标记对武运2674、武运粳27、镇稻18等3个受体进行检测。发现武运2674含、这两个抗性基因；武运粳27含、两个抗性基因，镇稻18含、、等3个抗性基因(表4)。

对3个受体亲本进行穗颈瘟接种鉴定，武运2674、武运粳27及镇稻18的抗性等级分别为9级(高感)、7级(高感)和5级(中感)，暗示+基因型组合对南方强毒力(高致病频率)的稻瘟病小种几乎不存在抗性，+的基因型组合仅减轻部分伤害，尽管提高了水稻的穗颈瘟抗性，但仍难以有效抵抗南方强毒力稻瘟病菌小种(表4)。

2.3 Pigm基因改良粳稻穗颈瘟的效果

分别以武运2674、武运粳27、镇稻18为母本，与谷梅4号杂交、回交，利用两翼标记Pigm-4及Pigm-2检测，三个亲本分别回交到BC5F1、BC4F1及BC4F1，对武运2674/谷梅4号衍生的BC5F1共计151个单株进行检测，发现利用Pigm-2标记检测到的基因型为、的个体分别是89、62株，而Pigm-4标记检测到的基因型为、的个体分别是92、59株，有5个交换单株(即两个标记基因型不一致的单株)，对武运粳27/谷梅4号BC4F1代93个单株进行检测，发现Pigm-2标记检测到的基因型为、的个体分别是43、50株，而Pigm-4标记有、的个体分别是41、52株，也有5个交换单株；对镇稻18/谷梅4号衍生的BC4F1代共计67个单株进行检测，发现Pigm-2、Pigm-4标记检测到的基因型为、的个体均为35及32株，但有4个交换单株(表5、图3)。

表5 Pigm-2及Pigm-4检测不同回交群体的基因型情况

之后对两个标记均为杂合带型的160个目标单株(3个群体分别是88、39、33株)的、、、等4个基因进行检测，88个武运2674/谷梅4号衍生的BC5F1单株均携带了纯合的、基因；武运粳27/谷梅4号BC4F1单株中携带、、、的有37个，有2个单株未检测到，镇稻18/谷梅4号BC4F1单株中基因型为、、、的单株有31个，也有2个单株未检测到。所以除杂合外，其余抗性基因与受体亲本一致的单株共有156个。

分别对携带杂合体的160个目标单株及区段内发生交换，但是其余抗性基因与受体亲本一致的14个单株接种鉴定(其中有2个单株因青枯病无法调查抗性等级)。结果显示导入基因的不同受体亲本的品系均能显著提高其对南方强毒力小种的穗颈瘟抗性(图3)。但在两个侧翼标记存在交换的12个单株中，8个Pigm-2位点纯隐性而Pigm-4位点杂合单株的抗病比例达到87.5%，而另外4株相反基因型单株的抗性频率为50%(图4)，表明2个标记距目标基因还有一定的距离，但是Pigm-4离目标基因更近。

图3 导入系内不同类型交换单株的抗性

Fig. 3. Resistant level of the recombination individuals between Pigm-2 with Pigm-4 of introgression lines.

3 讨论

座位是一个含有9个NBS-LRR元件的基因簇，迄今至少已发现了、、、-、6、、等8个复等位基因，其中、被认为是起主要作用，是，而则在位置上产生了4次复制。Deng等[22]成功实现了对的克隆，研究表明包含13个元件的基因簇，这可能也是较-等其他等位基因抗谱更广的主要原因，且受()与()共同作用，维持水稻抗性与产量的平衡，其中，表现出表观遗传的特征，在不同部位表达量有显著差异。通过比对发现本研究标记Pigm-4位于启动子区，谷梅4号Pigm-4标记所在区段的序列与、、、-的供体亲本及绝大多数水稻品种均不相同，表现出谷梅4号基因组特异的现象，对于谷梅4号是如何进化得到这些特异序列，以及它与其抗性的维持是否存在一定的相关性，还有待深入研究。

参照日本晴基因组，基因位于水稻第6染色体10 036 773―10 042 226 bp内。在第6染色体短臂上鉴定和分离了多个重要农艺性状相关基因，如品质基因[23]、[24]，生育期基因[25]、[26]，广亲和基因S[27]及其他基因，它们之间存在一定的互相连锁关系，如控制抽穗期的主效基因就位于9 336 376―9 338 569 bp处，与连锁。所以，要在导入广谱抗稻瘟病基因的同时保留受体亲本优良性状，就需要经过多次的回交筛选，而用于筛选的标记与目标基因越为紧密，目标基因不丢失及导入不良连锁片段的可能性就越小。本研究利用的两个标记与目标基因紧密连锁，且其中Pigm-4具有基因组特异性，Pigm-2位于上游2 kb处，二者配合可以确保将基因簇同时导入受体。

1－武运2674；2－武运2674(Pib+Pi54+Pigm)；3－武运粳27；4－武运粳27(Pi54+Pita+Pigm)；5－武运粳27(Pita+Pigm)；6－镇稻18；7－镇稻18(Pib+Pi54+Pb1+Pigm)；8－镇稻18(Pib+Pi54+Pigm)。

Fig. 4. Resistance level of different combination patterns of R genes.

不同课题组对的抗谱测定均证明该基因具有广谱抗性，但是本研究进一步证明目前江淮稻区推广的粳稻品种中并不存在基因型。因此，将导入到粳稻品种，可能有助于显著改良粳稻的稻瘟病抗性。研究表明有些稻瘟病基因的抗性也会因背景不同而存在差异，如[28-29]。本研究利用分别携带不同抗性基因的长江中下游三种不同生态型的粳稻品种(中熟中粳、迟熟中粳、早熟晚粳)为受体，重点考查了不同粳稻背景下对提升粳稻穗颈瘟抗性的效应，结果表明，江淮稻区粳稻品种虽然携带了部分稻瘟病抗性基因，但是对强毒力的南方小种抗性水平普遍较低，所以一旦本地稻瘟病小种发生变化，极有可能引起当地稻瘟病灾害的暴发，而在不同的粳稻背景中均可有效提升其对水稻穗颈瘟的抗性等级，达到高抗水平，进一步证明可以与其他抗稻瘟病基因“兼容”，在改良粳稻稻瘟病抗性育种中加以利用。

需要指出的是，Deng等[22]研究表明基因本身对水稻的产量性状也存在一定影响，即在降低千粒重同时增加结实率从而保证水稻不减产，不过该研究的粳稻受体品种为日本晴和意大利的原始品种Maratelli，从生产的角度出发，它们的农艺性状较当前粳稻主栽品种存在明显差距。例如目前主推常规粳稻的结实率一般达90%以上(如本研究3个受体品种的结实率均在93%左右)，所以是否可维持主推常规粳稻品种的产量平衡还需进一步验证。本研究到目前为止只回交了4~5代，要准确评价在粳稻育种中的利用价值，还需要继续回交自交以纯化背景，并进一步考查该基因对其他农艺性状的影响。

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Development of Specific Markers forin Marker-Assisted Breeding ofPanicle Blast ResistantRice

Zeng Shengyuan, Li Chuang, Du Cancan, Sun Liting, Jing Dedao, Lin Tianzi, Yu Bo, Qian Huafei,Yao Weicheng, Zhou Yiwen, Gong Hongbing*

(,,;*,:.)

【Objective】is a broad-spectrum resistance gene to rice blast, which is isolated from Gumei 4, a variety with durable resistance.is allelic to,,,,and so on, but shows different resistance spectrum. To breed resistance variety carryingwith molecular marker-assisted selection, discovering-tightly-linked markersis important.【Method】We identified a unique DNA sequence of Gumei 4 by genomic sequencing, and developed a set of specific markers tagged tobase on the sequence divergenceThen, by means of molecular-assisted selection and background gene screening,was pyramided to three representativevarieties belonging to different ecotypes from Yangtze-Huai River Area. 【Result】An InDel marker Pigm-4 which is closely linked to the functional unit ofwas developed. Pigm-4 showed distinct specificity by genotype screening of various rice varieties, and can distinguish the genotype offrom its alleles,,,and. Although receptors carry with resistant genes such as+(Wuyun 2674),+(Wuyunjing 27),++(Zhendao 18),respectively, but none of them can defense high virulence blast pathogen. Relevant introgression lines were established and inoculations of introgression lines indicate thatcan promote resistance level to rice panicle blast significnatly in differentbackgrounds. 【Conclusion】can be used as a beneficial gene source in the breeding of blast resistantrice, and Pigm-4 is an excellent marker for themolecular marker-assisted selection of.

; specific-marker;rice; panicle blast; resistance

Q755; S511.034; S435.111.4+1

A

1001-7216(2018)05-0453-09

2017-11-09;

2018-01-30。

国家重点研发计划资助项目(2017YFD0100400)；镇江市科技支撑计划资助项目(NY2015018)；江苏省重点研发计划资助项目(BE2015363)；江苏省农业科技自主创新资金资助项目[CX(16)1029]。

10.16819/j.1001-7216.2018.7135