鸟苷酸激酶OsGK1对水稻种子发育至关重要

李景芳 田云录 刘喜 刘世家 陈亮明 江玲 张文伟 徐大勇 王益华,* 万建民



鸟苷酸激酶OsGK1对水稻种子发育至关重要

李景芳1田云录1刘喜1刘世家1陈亮明1江玲1张文伟1徐大勇2王益华1,*万建民1

(1南京农业大学 作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业部长江中下游粳稻生物学与遗传育种重点实验室/长江流域杂交水稻协同创新中心/江苏省现代作物生产中心，南京 210095；2连云港市农业科学院 江苏 连云港 222000；*通讯联系人，E-mail: yihuawang@njau.edu.cn)

【目的】对水稻粉质皱缩突变体进行表型分析及基因克隆，为阐明水稻淀粉合成机制以及胚的发育奠定基础。【方法】来自粳稻品种滇粳优1号的MNU(N-甲基-N-亚硝基脲)诱变突变体库。本研究考查了突变体籽粒的理化性状，利用扫描电镜和半薄切片观察了淀粉颗粒的结构；构建了与N22的F2群体，通过图位克隆及转基因互补验证确定目标基因；通过qRT-PCR以及GUS活性染色对进行组织表达分析；免疫印迹分析了突变体中淀粉合成相关基因以及线粒体基因的蛋白变化。【结果】籽粒粉质皱缩，千粒重显著下降；胚乳中淀粉颗粒变小变圆，排列松散，不能形成正常的复合淀粉颗粒；突变体中总淀粉、直链淀粉含量均显著下降，脂肪含量显著上升，突变体淀粉的糊化特性发生明显改变。编码一个线粒体和质体双定位的鸟苷酸激酶(guanylate kinase)，命名为OsGK1。在各器官中组成型表达，并在花后6 d的胚乳中表达水平最高。突变体胚乳中淀粉合成相关蛋白水平显著降低，尤其是AGPS2b和PHOI。此外，突变体的胚发育严重受损，导致种子纯合致死；线粒体定位的AOX积累显著增强，而野生型中几乎检测不到，表明线粒体呼吸途径受损。【结论】由于OsGK1的功能缺陷，导致水稻种子中线粒体和造粉体发育异常，进而产生了胚致死以及胚乳粉质皱缩的表型，因此OsGK1对水稻种子的发育至关重要。

水稻；粉质皱缩胚乳；鸟苷酸激酶；种子发育；淀粉合成

水稻(L.)是世界一半以上人口的主要食物，提高水稻产量和品质是水稻遗传改良最主要的目标[1]。胚乳作为水稻籽粒的可食用部分，其发育直接影响稻米的产量和品质。水稻成熟胚乳中主要含有淀粉、贮藏蛋白、脂质等成分，其中，淀粉含量最高，约占胚乳干质量的70%。因此，淀粉的合成量很大程度上决定了稻米的产量，同时淀粉含量、组成和结构对稻米的品质起着决定性作用。因此，深入研究淀粉的合成及其调控机制对提高稻米产量、改良稻米品质具有重要的意义[2-4]。

谷类作物中淀粉在胚乳造粉体(一种特化的质体)中合成[5]。稻米中的淀粉分为直链淀粉和支链淀粉。直链淀粉是由α-1,4-糖苷键连接组成的线性分子，而支链淀粉是线性链上具有高度分支的α-1,6-糖苷键的葡聚糖分子。支链淀粉分子具有明显的簇状结构，占储存淀粉的65%~85%[6]。高等植物中淀粉的生物合成主要通过4类酶：ADP葡萄糖焦磷酸化酶(ADP glucose pyrophosphorylase, AGPase)、淀粉合酶(starch synthase, SS)、淀粉分支酶(starch branching enzyme, SBE)以及淀粉脱分支酶(debranching enzyme, DBE)[6-8]。此外，有证据表明歧化酶(disproportionating enzyme, DPE)[9-11]和α-葡聚糖磷酸化酶(α-glucan phosphorylase, PHO)[12,13]也参与了该过程。

鸟嘌呤核苷酸(guanosine monophosphate, GMP)是许多化学反应的主要能源，也是DNA、RNA和一些信号分子如环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)的结构单元，cGMP是多种激素诱导的胞内第二信使，参与调解许多生化反应过程，如通过控制细菌的活动来调解植物的免疫响应[14,15]。高等植物中GMP的生物合成通过两种途径实现：一种是利用氨基酸和其他小分子的从头合成途径；另一种是通过预先形成的鸟嘌呤和鸟苷的补救途径。合成的GMP随后可以被磷酸化为鸟苷二磷酸(guanosine diphosphate, GDP)和鸟苷三磷酸(guanosine triphosphate, GTP)。GDP和GTP是植物进化过程中保守的重要能量分子，驱动细胞中许多重要的酶促反应。在蛋白质合成过程中尤为重要，多肽链上每添加1个氨基酸需要消耗2分子GTP，因此GTP在细胞分裂旺盛的部位分布较高[16-19]。虽然高等植物中GMP的合成过程与动物及微生物相似，但高等植物中上述途径的调控网络比动物中更加复杂。这种增加的复杂性源自植物细胞中多种质体的存在，其可以分化成各种类型的细胞器，例如叶绿体、造粉体和有色体等[15,20]。

鸟苷酸激酶(guanylate kinase, GK)是鸟嘌呤代谢通路中的关键酶，催化(脱氧)GMP磷酸化形成(脱氧)GDP。GK在第二信使cGMP(cGMP→GMP→GDP→GTP→cGMP)的循环中也起重要作用，调节鸟嘌呤核苷酸在信号转导途径中各组分的供应[21]。目前，对动物和微生物中GK的生物化学、遗传学的调控已经开展了许多研究[22-27]。人类GK在用于治疗癌症和病毒感染的作用引起了极大关注[22, 23]。同样地，高等植物中GK的功能也引起了研究者的关注[20, 28-31]。水稻GK突变体()具有温度依赖性，在20℃时叶片中不含有叶绿体而表现白化，而在30℃时叶色正常。编码一个包含285个氨基酸的蛋白，同时定位于质体和线粒体。中基因的突变导致第162位缬氨酸被异亮氨酸代替，从而抑制了早期质体遗传系统中质体转录本的翻译，导致叶绿体分化受阻。因此，OsGK1/V2在叶片早期发育过程中调控质体翻译体系的建立[30]。细菌和动物中的研究表明GK定位于细胞质中，能够为许多基本的细胞学过程提供所需的鸟嘌呤。但植物中同样存在这种胞质定位的鸟苷酸激酶(cytoplasm guanylate kinase, cGK)，对拟南芥cGK的RNA干扰植株进行表型分析表明，cGK对植物生长发育不可或缺，但并非叶绿体发育所必需[31]。上述研究表明植物系统中存在两种类型的GK，在水稻中只有pt/mt(plastid target/ mitochondria target) GK是叶绿体分化所必需，但GK与水稻胚乳中的质体-造粉体的关系未见报道。

本研究以从粳稻品种滇粳优1号的甲基亚硝基脲(1-methyl-1-nitrosourea, MNU)处理突变体库中筛选到的粉质胚乳突变体为材料，对其籽粒的理化性状进行测定，并对胚乳淀粉结构进行观察。通过图位克隆及转基因互补发现，编码OsGK1蛋白。借助细胞学、生物信息学手段，以及免疫印迹等实验，阐述OsGK1与造粉体发育的关系。为深入解析水稻胚乳中淀粉合成及胚发育提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

是在粳稻品种滇粳优1号MNU突变体库中筛选得到的一份稳定遗传的粉质皱缩胚乳(floury and shrunken endosperm)突变体。选择杂合单株与籼稻品种N22配制杂交组合用于基因的图位克隆。材料种植于南京农业大学实验基地。

1.2 扫描电镜观察

参照Kang等[32]的方法，用刀片将成熟的种子横向截断，后续样品的制备由南京农业大学生命科学学院电镜实验室完成，采用日立S-3000N电子扫描显微镜观察和拍照记录。

1.3 胚乳半薄切片观察

取灌浆10 d的胚乳，参照Peng等[33]所述方法切成1 μm厚度的薄片。切片用0.05% I2-KI溶液染色后，在Zeiss AX10荧光显微镜下观察和拍照。

1.4 成熟种子理化指标测定

成熟种子去壳后磨成糙米粉并过筛(孔径为0.15 mm)，50℃下烘干至恒重。总淀粉含量使用Megazyme总淀粉测定试剂盒测定；直链淀粉含量按照农业部标准NY147－88测定；总脂肪含量使用FOSS公司Soxtec 2050全自动脂肪测定仪测定。每个样品重复3次，取平均值。支链淀粉链长分布的测定参照Satoh等[13]的方法进行。

配制0~9 mol/L梯度浓度的尿素溶液，用乙酸调节pH值至6.0。在1.5 mL 离心管中准确称取20 mg糙米粉，分别加入1 mL上述尿素溶液，涡旋振荡均匀后室温放置24 h。随后8 000×下离心20 min，静置1 h之后计算各离心管中可溶部分的体积，淀粉颗粒的膨胀体积＝总体积(1 mL)－可溶部分体积。每个样品重复3次，取平均值。

准确称取3.0 g烘干的米粉，加入25 mL蒸馏水混合均匀，使用RVA (Rapid Visco Analyzer, 瑞典波通公司)快速黏度分析仪测定黏度特性。

1.5 FSE2基因的图位克隆

分单株收取/N22 F1植株上的F2种子，并从中选取与突变体表型一致的粉质皱缩籽粒。由于种子纯合致死，将极端个体浸水24 h后利用CTAB法提取种子DNA，用于基因定位。InDel标记来自RiceVarMap (http://ricevarmap.ncpgr.cn/)。PCR体系包括DNA模板1 μL，前后引物(2 μmol/L)各1 μL，dNTPs(10 mmol/L) 0.03 μL，r0.1 μL，10×缓冲液 1 μL，ddH2O 5.9 μL。产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，0.1% AgNO3染色，0.4%甲醛溶液(/)显色。

突变体种子纯合致死，无法诱导出愈伤组织，因此利用杂合植株分离的透明种子进行转基因互补试验。提取T0代转基因植株叶片的DNA，分别进行杂合位点和转基因阳性(前引物位于基因编码区，后引物位于载体序列，片段大小为883 bp)的PCR检测。收获杂合背景的转基因阳性植株上的种子(T1代)，单粒播种，发芽长苗后提取幼苗DNA检测突变位点(引物F/R，野生型为429 bp，突变体为359 bp)，当突变位点纯合而种子表现透明视为互补。

1.6 RNA提取以及qRT-PCR

使用TIANGEN公司的植物总RNA提取试剂盒，提取不同组织的总RNA。反转录得到cDNA后，使用SYBR Premix ExTM(TaKaRa)，在ABI PRISM 7500HT仪器上扩增，进行qRT-PCR分析，以水稻基因作为内参。反应体系包括cDNA模板8.0 μL(约50 ng)，2×SYBR Premix ExII 10 μL，前后引物(10 µmol/L)各0.8 μL，50×ROX参比染料0.4 μL。采用2法进行计算。

1.7 氨基酸序列比对等生物信息分析

在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索并下载不同物种鸟苷酸激酶的同源蛋白，使用MEGA 5.0软件进行氨基酸序列的比对和分析。利用SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/) 和TargetP 1.1 Server(http:// www. cbs. dtu. dk/services/TargetP/)进行OsGK1定位信号预测。

1.8 GUS染色

GUS工作液含50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.2)，0.1% Triton X-100，2 mmol/L K3Fe(CN)6，2 mmol/L K4[Fe(CN)6]·3H2O，10 mmol/L EDTA，2 mmol/L X-Gluc。加入适量配制好的GUS染液于15 mL离心管中，将待测转基因样品浸入，放入37℃培养箱过夜后用100%乙醇脱色5 h，然后拍照记录。

1.9 TTC染色

取种子20粒，去除颖壳，30℃清水浸种24 h后，用吸水纸除去籽粒表面水分，放入10 mL试管中，加入10 mL 5% TTC染液(TTC粉末溶解于pH=7.0磷酸缓冲液中)，35℃黑暗下2 h染色完毕，用蒸馏水冲洗3次。野生型和突变体各3个重复。

1.10 SDS-PAGE及Western blotting

提取成熟种子胚乳总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳。电泳结束后利用湿转设备(Bio-Rad公司)将蛋白转印到孔径为0.45 μm的聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF膜)，然后将PVDF膜在5%脱脂牛奶(PBST溶解)中封闭1 h；再移至新的封闭液中加入一抗(1∶1000)孵育2 h；PBST漂洗PVDF膜3次，每次5 min；将PVDF膜转移至封闭液稀释的二抗溶液(1∶5000)中孵育1 h；PBST漂洗PVDF膜5次，每次5 min。采用化学发光法(ECL)曝光。内参抗体为ACTIN单克隆抗体(Sigma公司)。

2 结果与分析

2.1 fse2突变体的表型分析

与野生型相比，突变体胚乳表现为粉质、皱缩。对成熟种子横切面观察发现突变体不透明部分主要是内胚乳(图1-A~C)。利用扫描电镜对种子内胚乳横截面观察，野生型中淀粉颗粒充实度高，排列紧密，相互挤压呈规则的多面体晶体形状(图1-E)，而突变体中淀粉颗粒排列松散，变圆变小(图1-F)。制备半薄切片并且通过I2-KI染色观察发育胚乳中复合淀粉粒的形态，在野生型花后10 d的胚乳中，每个造粉体内部能产生多个独立的淀粉颗粒(starch granule)，这是水稻典型的复合淀粉粒结构(compound starch grain)(图1-G~H)。而突变体中，复合淀粉粒变小，其中的淀粉颗粒数目显著降低；还存在许多小的、零散分布的单粒淀粉粒(图1-I~J)。因此，对于水稻的造粉体发育具有重要作用。此外，与野生型相比，成熟种子的千粒重降低了约35.3%(图1-K)，同时，的粒长和粒宽均较野生型极显著增加，而粒厚则极显著减小(图1-B、D、L)。

A，B，D—滇粳优1号(DJY)与fse2的成熟种子的外观表型；A，DJY(左)，fse2(右)。B和D，DJY(上)，fse2(下)。C—DJY(左)与fse2(右)种子的横切面。E，F—DJY(E)和fse2(F)成熟种子横切面的SEM观察。G~J—花后10 d I2-KI染色的DJY(G，H)和fse2(I，J)胚乳半薄切片。K—DJY和fse2的千粒重比较，n=3；L—DJY和fse2的粒长、粒宽和粒厚，n=20。所有数值为平均值±标准差；**野生型与突变体间的差异达0.01显著水平(t测验)。

Fig. 1. Phenotypic comparison of mature seeds of wild type andmutant.

2.2 fse2与野生型种子理化特性的比较

相对于野生型，突变体成熟籽粒中总淀粉含量和直链淀粉含量显著降低，分别下降11.67%、15.28%(图2-A、B)，而脂肪含量增加58.25%(图2-C)。此外，胚乳淀粉中支链淀粉链长分布发生明显改变，其聚合度(degree of polymerization, DP)为9~12和16~29的链长比例明显下降，而DP 为13~15的链长比例显著升高(图2-D)。RVA谱分析发现，突变体淀粉的黏度曲线与野生型具有极显著差异(图2-E)。突变体淀粉的最高黏度(peak viscosity, PKV)出现的时间早于野生型，其崩解值(breakdown viscosity, BDV)、消减值(setback viscosity, SBV)、冷胶黏度(cool pasting viscosity, CPV)等都极显著低于野生型(表1)。

A~C—滇粳优1号(DJY)和fse2胚乳中总淀粉(A)、直链淀粉(B)和脂肪(C)含量的测定，n=3，取平均值±标准差，采用t测验，**P<0.01；D—DJY和fse2支链淀粉链长分布；E—DJY和fse2淀粉的RVA谱分析；F—DJY与fse2米粉的膨胀体积比较(n=3)；G—DJY与fse2的尿素膨胀。

Fig. 2. Physicochemical characteristics of mature seeds ofand its wild type.

表1 野生型和突变体fse2淀粉的RVA谱特征分析

对野生型和突变体米粉的凝胶特性测定表明，突变体米粉较野生型米粉更难溶于尿素(图2-F、G)。野生型米粉在4 mol/L尿素中明显开始溶解，而米粉几乎无变化，直至5 mol/L时米粉才出现轻微的溶解。当尿素浓度达到9 mol/L时野生型米粉已接近完全溶解，而米粉膨胀体积与野生型在6 mol/L尿素中的膨胀体积相当(图2-F、G)，说明的支链淀粉结构发生了显著变化。综上所述，突变显著改变了胚乳淀粉的理化性质。

表2 fse2遗传分析

2.3 FSE2基因的图位克隆

种子纯合致死，杂合植株上所结种子透明胚乳与粉质胚乳分离比符合3∶1(c2<3.84)(表2)，表明由一对隐性核基因控制。从与N22配制的杂交组合的F2种子中，挑选出350个与突变体表型一致的隐性极端个体进行基因定位，将定位于第3染色体短臂的标记LJF3-16与LJF3-17之间约106 kb区域内(图3-A)。利用水稻数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)查询该区间，预测存在11个开放读码框(open reading frame, ORF)。对这11个ORF的基因组测序发现，突变体中第1外显子上存在3个SNP，并且包含70 bp的缺失(图3-B、C)。实时PCR检测发现，花后10 d种子中的表达水平约为野生型的13.33%(图3-E)。基因组全长3608 bp，包含4个外显子和3个内含子(图3-B)，编码序列长858 bp，编码一个含有285个氨基酸的鸟苷酸激酶，C端包含一个GuKc功能结构域(图3-D)，我们将该基因命名为。通过数据库比对发现，不同植物中的鸟苷酸激酶均含有GuKc结构域，并具有较高的蛋白序列相似性，且均含有鸟苷酸激酶催化位点(图4)。在突变体中，由于70 bp缺失导致蛋白翻译提前终止，编码一个仅有68个氨基酸的短肽，但只有N端20个氨基酸与野生型一致(图3-D)，缺失了GuKc结构域及其催化位点(图3-D)，因此很可能是OsGK1的功能丧失突变体。

为进一步确定就是的突变基因，将构建好的CaMV 35S启动子驱动全长cDNA的载体，转化杂合体植株分离出的透明种子愈伤。对转基因阳性且背景杂合的T0代植株上的透明种子(T1)发苗提取DNA并进行PCR鉴定。从图3-F~H中可以看出，在转基因杂合家系CP-1的#3和#4种子及CP-2的#3和#7种子，具有纯合的突变体背景，且为转基因阳性，说明它们是转基因互补的种子。综上所述基因的突变导致了的突变表型。

2.4 FSE2的组织表达分析

实时荧光定量PCR显示，在各器官中呈组成型表达，在叶片和叶鞘中表达量较高(图5-A)。此外，在胚乳发育的整个过程中也有表达，并且在花后6 d达到峰值(图5-B)。同时，我们构建了启动子驱动基因的表达载体转化到日本晴中，对转基因阳性植株不同组织的GUS染色发现，在根、叶、叶鞘、小花均能检测到GUS活性(图5-C~F)，同时发育种子中也能检测到GUS的活性，且在花后6 d表达量最高。这些与荧光定量的结果相吻合(图5-G~L)。

2.5 FSE2突变影响了胚的正常发育

种子的萌发实验表明，野生型的种子吸胀后胚能正常萌发生长，而突变体几乎不能萌发(图6-A)。进一步利用TTC法测定种子活力发现，野生型的胚能够染成红色，而突变体种子的胚几乎不能着色(图6-F)，推断突变体胚的正常发育受到了影响。因此，我们切开吸胀后的胚发现，突变体的胚无明显的结构分化，而野生型中结构分化明显，显示中胚发育的缺陷(图6-B、C)。同时，发育中期种子胚的横切面也观察到了相同的结果(图6-D、E)。蛋白结构分析表明，在OsGK1的N端包含线粒体和叶绿体的定位信号，且前人的研究已经证实该蛋白能够在线粒体和质体双定位[31]。因此，我们推测的线粒体中缺乏有功能的OsGK1蛋白，导致线粒体功能障碍引起胚致死。因此，对突变体种子中线粒体蛋白进行了免疫印迹分析，结果表明中线粒体CytC(cytochrome c biogenesis C)和COX2 (cytochrome c oxidase subunit 2)的积累量超过野生型，而AOX(alternative oxidase)则在突变体中严重过量积累。此外，线粒体NADH9(NADH dehydrogenase subunit 9)亚基的蛋白水平略有下降(图6-G)。上述结果表明突变体中线粒体的正常功能受损，这可能是导致胚发育缺陷的原因。

2.6 FSE2突变影响了淀粉的合成

A―FSE2位点的图位克隆，FSE2定位在第3染色体短臂标记LJF3-16与LJF3-17之间约106 kb区域内，包含11个预测基因；B―Os03g0320900基因结构和突变位点，序列中存在3处单碱基替换(红色三角)和70 bp的缺失(红色方框)。引物F/R用于鉴定转基因家系CP-1、CP-2中透明种子的遗传背景；C―PCR鉴定FSE2基因中70 bp的缺失；D―FSE2蛋白的定位信号及结构域，在fse2中共有68个氨基酸，但只有N端20个氨基酸与野生型保持一致(虚线左边)；mTP―线粒体转运肽；cTP―叶绿体转运肽；aa―氨基酸；E―FSE2在DJY和fse2发育种子中(开花10 d后)的相对表达量；F―具突变体背景的阳性转基因种子(CP-1 #3和CP-2 #7)恢复为正常表型，CP-1和CP-2为具有杂合突变体背景的转基因阳性家系，标尺为1 cm；G，H―CP-1家系(G)和CP-2家系(H)后代透明种子的PCR鉴定。G和H中上图均为转基因阳性鉴定结果，下图均为遗传背景检测结果，红色星号表示纯合突变体背景的阳性转基因种子。DJY―滇粳优1号。

Fig. 3. Map-based cloning of.

红色方框区域代表鸟苷酸激酶催化位点；GenBank蛋白质登录号：水稻，XP_051628708.1；拟南芥，NP_566276.1；玉米，NP_001149581.1；二穗短柄草，XP_003561683.1；毛果杨，XP_006380050.1；葡萄，XP_002279802.1；大豆，XP_003542897.2。 The red box indicates the catalytic site of GK; GenBank protein accession number are as follows O. sativa, XP_051628708.1; A. thaliana, NP_566276.1; Z. mays, NP_001149581.1; B. distachyon, XP_003561683.1; P. trichocarpa, XP_006380050.1; V. vinifera, XP_002279802.1; G. max, XP_003542897.2.

Fig. 4. Protein sequence alignment of FSE2 and its homologs.

A—FSE2在叶、穗子、鞘、根中的表达量；B—FSE2在花后3、6、9、12、15和18 d的发育胚乳中的表达量；C~F—根(C)、叶(D)、鞘(E)、小花(F)的GUS染色；G~J—开花后6(G)、9(H)、12(I)和15 d(J)的发育胚乳的GUS染色。

Fig. 5. The expression patterns of.

由于突变体种子皱缩，具有明显的淀粉合成缺陷。因此，对胚乳中淀粉合成相关蛋白进行了免疫印迹分析。突变体中胞质AGPase亚基(AGPS2b)蛋白水平显著降低，大量研究表明AGPS2b的突变会产生粉质皱缩的胚乳[34-36]。质体磷酸化酶(PHOⅠ)的蛋白水平也明显下降，PHOⅠ水平降低会产生不同程度的粉质胚乳，其中包括种子皱缩[13]。同时，3个支链淀粉合成相关基因(,,)及胞质PPDKB的蛋白水平也均显著低于野生型(图6-H)。这些结果表明胚乳中的淀粉合成发生了明显改变。因此，突变同样引起了质体(造粉体)的功能缺陷，显著降低了部分淀粉合成相关蛋白的积累，导致淀粉合成剧减，造成种子皱缩表型。

A—野生型和突变体fse2种子萌发后2 d的表型；B，C—野生型和突变体fse2种子吸胀后的胚(30℃下吸胀9 h)，比例尺为1 mm；D，E—花后15 d野生型和突变体的胚，比例尺为1 mm；F—TTC法测定种子活力；G—Western blotting检测野生型和突变体成熟种子中的线粒体相关蛋白含量。CytC―细胞色素c合成酶C；COX2―细胞色素c氧化酶亚基2；NADH9―NADH脱氢酶亚基9；ATPβ―ATP合酶F0亚基6；AOX―交替氧化酶；H—Western blotting检测野生型和突变体成熟种子中淀粉合成相关酶蛋白含量，AGPL2―腺苷葡萄糖焦磷酸化酶大亚基2；AGPS2b―腺苷葡萄糖焦磷酸化酶小亚基2b；PPDKB―胞质丙酮酸磷酸双激酶B；PHOⅠ―质体磷酸化酶Ⅰ；BEⅠ―淀粉分支酶Ⅰ；BEⅡb―淀粉分支酶Ⅱb；SSⅡa―淀粉合酶Ⅱa；G，H中以ACTIN作为内参。DJY―滇粳优1号。

Fig. 6. The abnormal development of embryo and endosperm in themutant.

3 讨论

淀粉是人类和畜牧业最主要的能量来源之一，同时也是重要的工业原料。水稻种子中积累了大量的淀粉，其主要功能是为种子萌发和幼苗生长提供能量，同时这些数量可观的淀粉也成为人类日常饮食的主要初级能量来源。水稻中淀粉积累水平直接影响水稻产量，同时种子中直链淀粉和支链淀粉的结构和比例决定了稻米的品质。因此，深入研究水稻淀粉合成的关键基因及调控网络，对种子的生长发育具有重要的生物学意义与育种应用价值。通过物理和化学等诱变方法，人们已经筛选获得了大量水稻胚乳异常突变体，主要有暗胚乳(dull endosperm)、糯性(waxy)、粉质(floury)、皱缩(shrunken)等表型，它们是解析胚乳发育过程中淀粉合成调控路径的优良材料。本研究通过筛选滇粳优1号MNU突变体库，获得一份粉质皱缩突变体，通过图位克隆及转基因互补证明/基因的突变导致了种子的粉质表型。

前人研究表明V2/OsGK1是叶绿体和线粒体双定位的蛋白，参与叶绿体分化过程中质体向核信号转导的过程。表现出叶片淡绿，在早期的叶片发育过程中，的突变并不影响NEP(Nuclear-encoded plastid RNA polymerase)途径，而是主要影响叶片发育后期的质体基因的表达，质体中的、、的转录水平受到强烈抑制，从而影响了水稻质体的发育，进而导致叶色变异[24,30]。但是对于OsGK1/V2在水稻种子发育中所扮演的角色还未有报道。

在突变体中，由于蛋白翻译的提前终止，仅正确翻译20个氨基酸，突变蛋白不仅丧失了鸟苷酸激酶的功能结构域GuKc，导致突变体中的鸟苷酸激酶的酶活性的丧失，而且突变蛋白的叶绿体和线粒体的定位信号也都出现不同程度的缺失，可能丧失了在植株体内的正确定位。因此，极有可能是鸟苷酸激酶功能丧失突变体。线粒体为植物生长代谢提供了主要的能量来源，线粒体的功能障碍会影响种子的正常生长发育。在本研究中，TTC染色表明突变体的种子活力大大降低，并且纯合致死。突变体中AOX过量积累，在野生型中则基本没有积累。AOX属于末端氧化酶，催化抗氰呼吸，说明突变体中交替途径(alternative pathway)增强。线粒体交替呼吸途径不经过线粒体复合体Ⅲ和复合体Ⅳ，不产生ATP或产生1个ATP，其余能量以热能形散失，P/O比为1，而细胞色素途径P/O比为2或3。细胞色素氧化酶的略微增加可能是由于主呼吸链受到抑制而出现的反馈机制[37-39]。线粒体NADH9也有所降低，这些都表明突变体中线粒体功能受损，影响了胚的发育，导致种子萌发过程受阻。对胚乳中淀粉合成关键基因的蛋白印迹分析表明，突变体中PHOI、BEI、SSIIa、BEIIb(质体定位)的蛋白水平均显著下降，而PHOI和BEIIb功能的削弱都能导致籽粒粉质皱缩[13]；突变体胚乳严重粉质皱缩[34-36]，中AGPS2b的含量也明显降低。因此，我们推测由于突变蛋白不能正确靶向到胚乳造粉体以及其酶活性的丧失，导致了造粉体发育的异常，产生粉质皱缩的胚乳。

此外，由于线粒体功能障碍将导致能量供应不足，进而影响突变体胚和胚乳的发育。如玉米突变体种子胚致死或者苗期致死、种子皱缩、籽粒变小，编码一个PPR(pentatricopeptide repeat)蛋白，通过影响线粒体的正常编辑引起线粒体功能障碍，使玉米胚和胚乳的发育受到影响。其在水稻中的同源基因()的突变体(_)籽粒变小、垩白、种皮皱缩，种子的生长发育极其缓慢，甚至产生致死表型[40]。因此线粒体的正常功能对种子发育极其重要。

种子胚发育的缺陷大多伴随着胚乳发育的异常，如玉米、、和突变体中胚和胚乳的发育都有缺陷且纯合种子致死[41-44]；水稻中缺少OsWDR5a胚和胚乳发育出现缺陷，表型为胚胎发生终止，突变体种子纯合致死，种子皱缩[45]。但在水稻MPK1功能丧失突变体中，成熟种胚变小且纯合致死，种子胚乳却表现为透明[46]。因此，种子胚和胚乳之间的发育可能不存在必然的联系。Huang等[47]指出基因突变导致胚胎早期发育模式异常，早期胚乳中游离核数目减少，糊粉层分化受到影响，造成种子纯合致死，胚乳出现垩白，且在胚和胚乳中都有表达，共同调控二者的早期发育。本研究中经网站(RiceXPro)预测在胚和胚乳中都有表达，推测该基因可能同时影响了胚和胚乳的正常发育，但二者的具体调控机制还需要进一步的实验探究。

综上所述，的突变导致种子中胚和胚乳的发育都受到了严重的阻碍，说明鸟苷酸激酶对植物体的生长发育至关重要，能够调控胚和胚乳的正常生长发育。

谢辞:感谢农业部长江中下游粳稻生物学与遗传育种重点实验室/长江流域杂交水稻协同创新中心/江苏省现代作物生产中心对本研究给予资助。

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The Guanylate Kinase OsGK1 is Essential for Seed Development in Rice

LI Jingfang1, TIAN Yunlu1, LIU Xi1, LIU Shijia1, CHEN Liangming1, JIANG Ling1, ZHANG Wenwei1, XU Dayong2, WANG Yihua1,*, WAN Jianmin1

(1,;Lianyungang Academy of Agricultural Science,,;*Corresponding author, E-mail: yihuawang@njau.edu.cn*)

【Objective】In this study, the phenotype of the floury and shrunken endosperm mutantwas analyzed. Isolation of the responsible gene will lay a foundation for elucidating the mechanism underlying starch synthesis and embryo development in rice. 【Method】was obtained from the mutant library ofcultivar Dianjingyou 1 induced with N-Nitroso-N-methylurea. In this study, the physiochemical properties ofendosperm were investigated and the structure of starch grains was observed. An F2population derived fromand N22 was constructed,then the underlying gene was determined by map-based cloning and complementation tests. qRT-PCR and GUS staining were used to analyze the expression of. Western blotting was performed to analyze the protein levels of starch synthesis related genes and mitochondrial genes in the mutant. 【Result】Compared with the transparent endosperm of wild type,displayed a floury and shrunken endosperm,significantly declined 1000-grain weight, smaller and loosely packed irregular compound starch grains. Total starch and amylose content decreased significantly, while the lipid content increased obviously in, and the gelatinization characteristics ofwere changed notably.encodes a guanylate kinase named OsGK1, which is dual-targeted to both mitochondria and plastids.was constitutively expressed in various organs with the highest level in developing endosperm at 6th day after flowering. The protein levels of most of the starch synthesis related genes in the mutant endosperm were significantly decreased, especially AGPS2b and PHOI. In addition, the homozygous seeds ofwere lethal and the development ofembryos was severely arrested. The accumulation of mitochondria AOX was notably elevated, while almost undetectable in the wild type, indicating the mitochondrial respiratory chain was impaired. 【Conclusion】Due to the functional defects of OsGK1, the development of mitochondria and amyloplasts are abnormal, leading to the embryo lethality and a floury and shrunkenendosperm.

rice (L.); floury and shrunken endosperm; guanylate kinase; seed development; starch synthesis

Q343.5; S511.01

A

1001-7216(2018)05-0415-12

10.16819/j.1001-7216.2018.8003

2018-01-15;

2018-03-17。

国家重点研发项目七大农作物育种专项(2016YFD0100101-08)；江苏省科技支撑计划资助项目(BE2015363，BE2017368)；江苏省农业科技自主创新资金资助项目[CX(16)1029]。