分子标记辅助选择改良C418对红莲型粳稻不育系的恢复力

张宏根 仲崇元 司华 刘巧泉 顾铭洪 汤述翥



分子标记辅助选择改良C418对红莲型粳稻不育系的恢复力

张宏根 仲崇元 司华 刘巧泉 顾铭洪 汤述翥*

(扬州大学 江苏省作物遗传生理国家重点实验室培育点/粮食作物现代产业技术协同创新中心/教育部植物功能基因组学重点实验室, 江苏 扬州 225009;*通讯联系人, E-mail: sztang@yzu.edu.cn)

【目的】高效选育红莲型(Honglian，HL)粳稻恢复系有助于HL型杂交粳稻育种，对促进三系杂交粳稻的发展具有重要的意义。【方法】是一个HL型恢复基因，来源于HL型籼稻强恢复系9311。前期研究中，在以9311为供体、日本晴为受体的一套染色体片段代换系中鉴定出携带的株系R1093。本研究利用R1093与BT型粳稻恢复系C418(携带)杂交，通过常规回交育种结合分子标记辅助选择技术，将导入C418中，进行与聚合育种；利用BT型、HL型六千辛A进行测交鉴定改良系的恢复力。【结果】共获得12个BC3F4株系和55个BC4F3株系，其中6个改良系的农艺性状已基本接近C418；测交鉴定结果表明聚合的改良系对HL型粳稻不育系的恢复度达到85%以上，可应用于水稻生产；对BT型粳稻不育系的恢复度提升效果不显著。【结论】聚合能有效改良BT型粳稻恢复系对HL型粳稻不育系恢复力，是选育HL型粳稻恢复系的一条重要途径。

粳稻；红莲型；恢复系；分子标记辅助选择

水稻是我国第一大粮食作物，促进水稻产量的增长有助于保障我国粮食安全。当前，我国水稻种植面积约0.3亿hm2，其中籼稻约占2/3，杂交籼稻约占籼稻种植面积的80%，而杂交粳稻只占粳稻种植面积的3%左右[1]。育种实践证明，杂交稻较常规稻有15%~20%的增产潜力[2]。因此，发展杂交粳稻是我国水稻增产的一条有效途径。

杂交稻分为三系法杂交稻与两系法杂交稻。三系法杂交稻利用的是质核互作雄性不育系，包台(Chinsurah BoroⅡ, BT)型、红莲(Honglian, HL)型、野败(Wild Abortive, WA)型水稻不育胞质的恢保关系不同，花粉败育时期及特征不同，育性遗传方式不同，被认为是3种代表类型[3]。三系杂交粳稻以利用BT型不育系为主。BT型不育系花粉三核期败育，败育时期相对较晚，花粉呈染败类型，BT型粳稻不育系不育性欠稳定，影响制种纯度[4]。为克服BT型粳稻不育系不育性欠稳定及细胞质单一的问题，育种家在杂交粳稻育种过程中探索利用其他不育细胞质。鉴于WA型不育系不育性稳定，在20世纪70年代育种家们便开展了WA型粳三系育种工作，但转育成的WA型粳稻不育系存在两大问题：一是开花习性差，二是难以筛选到强恢复源，致使WA型粳稻不育系难以利用。HL型不育系花粉为圆败类型，与BT型不育系染败花粉相比，花粉败育相对彻底。本课题组通过多年研究发现，HL型粳稻不育系的开花习性及异交结实性与BT型粳稻不育系无显著差异，而不育性较BT型不育系稳定，可恢复性虽不如BT型不育系，但远优于WA型不育系[5-8]，可以选育HL型粳稻不育系及相应恢复系来配制杂交粳稻新组合。HL型不育系与BT型不育系均属于配子体不育类型，具有类似的恢保关系[8]，因此HL型粳稻不育系可以由主栽粳稻品种直接转育，目前本课题组已培育出多个HL型粳稻不育系。对HL型粳稻恢复系筛选研究发现，现有大多数BT型粳稻恢复系对HL型不育系只具有部分恢复力，难以直接用于杂交稻配组[8]。因此，加强HL型粳稻恢复系的选育对于促进HL型三系杂交粳稻在生产上应用具有重要的意义。

有关BT型恢复基因的遗传与定位，大多数研究认为BT型恢复系带有1对恢复基因，并将该基因定位于第10染色体长臂上，在位点内存在两个育性恢复基因和，且上位于[9, 10]。HL型恢复基因遗传研究主要集中在籼稻核背景下。多数研究认为HL型籼稻不育系的育性恢复受1对基因控制，绝大多数恢复系所带的恢复基因为，该基因与BT型恢复基因为同一基因；但HL型强恢复系9311除携带外，它还携带位于第8染色体上的一个恢复基因[11-15]。目前，尚未见有关用于杂交粳稻恢复系选育的报道。

C418是一个配合力较强的BT型粳稻恢复系，利用C418已选育了多个杂交粳稻组合，如屉优418、泗优418、9优418、3优18、陵香优18、陵风优18、双优18等。C418与大多数BT型粳稻恢复系一样，对HL型粳稻不育系仅具有部分恢复力。本课题组在前期研究中，从以9311为供体、日本晴为受体的一套染色体片段系中鉴定出1个携带HL型恢复基因的代换系R1093[16]。本研究通过常规回交育种结合分子标记辅助选择技术，将导入BT型粳稻恢复系C418中；在此基础上，分析导入的改良系对HL型粳稻不育系的恢复力，探索选育HL型粳稻恢复系的途径。

1 材料与方法

1.1 实验材料

受体品种为BT型粳稻恢复系C418(携带恢复基因)，由辽宁省农业科学院选育；供体品种为以9311为供体的日本晴背景代换系R1093(携带恢复基因)。测配亲本为BT型、HL型粳稻不育系六千辛A及BT型粳稻不育系52605A。上述代换系及不育系材料均由本课题组选育。

1.2 恢复基因聚合系的选育

试验于2012年至2016年分别在扬州大学实验农牧场和海南陵水扬州大学南繁基地进行。2012年冬季海南，种植各亲本，同时配制52605A/C418和C418/R1093这2个F1组合。

2013年正季扬州，种植所配F1组合，以C418为母本，配制C418//C418/R1093 BC1F1组合，收获52605A/C418 F1植株上种子。

2013年冬季海南，种植BC1F1群体，田间观察表型并结合分子标记检测结果选择带有的单株为父本与C418杂交，同时温室种植52605A/C418 F2群体。

2014年正季扬州，种植BC2F1群体，结合分子标记检测结果选取基因型为的单株作父本进行回交，并筛选优良单株留种。

2014年冬季海南，种植BC2F2、BC3F1群体, 在BC3F1群体中继续选取目标单株回交；在BC2F2群体中选取1株基因型为、6株基因型为的植株及C418分别与HL型六千辛A配制相应的测交F1；在BC3F1群体中，结合分子标记检测结果筛选优良单株留种。

图1 恢复基因聚合系的选育过程

Fig. 1. Breeding scheme of the improved lines.

2015年正季扬州，种植BC3F2、BC4F1和测交F1；在BC3F2、BC4F1群体中，结合分子标记检测结果筛选优良单株留种。

2015年冬季海南，种植BC3F3、BC4F2株系。从这些株系中，随机选择10株纯合基因型植株及C418分别与BT型、HL型六千辛A测交；筛选出6个位点纯合且农艺性状与C418相近的株系。C418回交改良过程如图1所示。

以上试验材料正季在扬州于5月10日播种，6月10日移栽，冬季在海南陵水12月15日播种，1月15日移栽，每行栽插10株，单苗栽插，株行距13.3 cm×25.0 cm，栽插密度为30万穴/hm2，水稻生长期间管理同一般大田。

1.3 水稻DNA的提取及PCR扩增

水稻基因组DNA提取采用CTAB法[17]，并稍作改进。检测的标记为RM407[16]，检测的标记为STS10-16[18]，引物序列列于表1。PCR扩增采用20 μL的反应体系：2.5 μL模板DNA、2 μL 10×缓冲液(不含Mg2+)、2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)、2 μL MgCl2(25 mmol/L)、1.6 μL 10 μmol/L的引物、0.2 μL的酶(5 U/μL)，11.7 μL ddH2O。PCR扩增程序：95℃下预变性5 min；94℃下变性40 s，53℃下退火40 s，72℃下延伸40 s，扩增30个循环；72℃下延伸10 min，4℃下保温。扩增产物在3%琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后在Bio-Rad凝胶成像系统下拍照并分析电泳结果。

表1 恢复基因连锁标记及引物序列

1.4 恢复基因聚合系的恢复力鉴定

2015−2016年正季扬州，待种子成熟后，选取测交系小区中部3~5株(2015年取样5株，2016年取样3株)考查整株自然小穗育性。

1.5 农艺性状调查

每个株系种植60株，2次重复。抽穗后记载各小区的始穗期，并折算成播始天数(播种至始穗的天数)。成熟后，每小区调查10株的穗数计算单株穗数；齐地面割取10个主茎，测定株高、剑叶、倒2叶、倒3叶叶片长度、剑叶出叶角度(剑叶基部与主茎的夹角)、茎粗、穗颈粗度(颈粗)、穗叶差(剑叶叶尖高度与穗尖高度的差值，剑叶叶尖高于穗尖为正值，剑叶叶尖低于穗尖为负值)、主茎穗长、主茎穗总粒数、一次枝梗数和穗弯曲度。

1.6 统计分析

数据利用SPSS 21.0软件进行处理，农艺性状及测交F1小穗育性按系与对照分别进行差异显著性测定。

2 结果与分析

2.1 C418所带恢复基因的验证

已有的研究表明，C418携带BT型恢复基因(/)[9]。为验证C418是否仅携带基因，2013年冬，在温室种植52605A/C418 F2群体，利用与紧密连锁的标记STS10-16对F2群体内94株单株进行检测，部分植株电泳结果如图2。

P1为52605A；P2为C418；1~44为52605A/C418 F2群体内单株。

Fig. 2. Molecular detection of 52605A/C418 F2individuals using STS10-16.

A－标记RM407扩增结果；B－标记STS10-16扩增结果。P1为C418；P2为R1093；1~40为C418//C418/R1093 BC2F2群体内单株。

Fig. 3. Molecular detection of C418//C418/R1093 BC2F2individuals.

**表示与C418测交F1的小穗育性存在极显著差异。C418和L1基因型为Rf1Rf1rf6rf6，L2~L7基因型为Rf1Rf1Rf6Rf6。

Fig. 4. Spikelet fertility of the testcrossing F1plants from the crosses between HL-Liuqianxin A and the improved lines, HL-Liuqianxin A and C418, respectively(2015).

表2 各世代的分子标记辅助选择结果

恢复基因频率指的是BCF1群体中基因型为植株比例，BCF2群体中基因型为植株比例。

Individuals with the genotypes ofandin BCF1and BCF2populations, respectively, are selected to analyze the frequency of.

表3 BT型、HL型六千辛A测交F1的小穗育性(2016)

**表示改良系与C418测交F1的小穗育性存在极显著差异。

All values are listed as mean±;**means significant difference in spikelet fertility between F1s from the improved lines and C418 at 0.01 probability level.

BT型不育系属配子体不育类型，若C418仅带，由于F1植株携有的配子不参与受精，52605A/C418 F2群体中位点仅出现与基因型，表现为双亲杂合带型及C418带型，且两种带型的植株比应为1∶1。从图2中可以发现，标记STS10-16在F2群体中仅扩增出双亲杂合带型及C418带型，其中扩增出杂合带型的植株51株，扩增出C418带型的植株43株，两者符合1∶1分离比(2=0.681<20.05,1=3.84)，表明C418仅带有1对主效恢复基因，即。

2.2 连锁标记的筛选及分子标记辅助选择结果

为HL型胞质雄性不育恢复基因，本实验室在粳稻核背景下对其精细定位过程中，共开发了61对SSR和InDel标记[16]，用这些标记对C418和R1093进行多态性分析，获得了14对在双亲间具有多态且具有较好扩增效果的标记，其中标记RM407与相距大约15 kb，与发生交换的概率非常低，从减少分子检测工作量的角度考虑，本研究仅选择RM407用于位点的检测；同时，我们选用标记STS10-16对位点进行检测。标记RM407及STS10-16对BC2F2群体内单株检测结果如图3所示。

2013－2016年间，利用标记RM407对不同回交世代群体内的单株进行检测，不同基因型植株检测结果见表2。

由表2可以看出，在标记RM407处，不同基因型的单株在各回交世代群体中分离比均接近理论值，说明利用该标记对位点选择是可行的。至2016年正季，共获得了12个BC3F4、55个BC4F3株系(基因型为)。

2.3 改良系对HL型粳稻不育系的恢复力鉴定

2014年冬季海南，在BC2F2群体中，根据标记检测结果，随机选择6株基因型为的植株、1株基因型为的单株及对照C418()分别与HL型六千辛A配组，共获得8个测交F1。2015年正季扬州，成熟后每个测交F1群体选取5株考查整株小穗育性，计算每个测交系的平均小穗育性，具体结果如图4。

由图4可以看出，C418与仅带的改良系(L1)对HL型六千辛A的恢复力无显著差异，携带的改良系(L2~L7)与HL型六千辛A的测交F1小穗育性均在90%左右，与对照相比，其测交后代的小穗育性极显著提高(<0.01)。这些结果初步表明，在C418中导入能显著增强其对HL型粳稻不育系的恢复力。

为进一步研究聚合恢复基因对HL型粳稻不育系育性恢复的效应及育种利用的可能性，2015年海南，从BC3F3、BC4F2株系中随机选取10株基因型为植株(株号为SL1~SL10)及C418分别与BT型、HL型六千辛A杂交，共获得22个测交F1。2016年扬州正季考查测交F1小穗育性(表3)。

由表3可见，受体亲本C418是BT型粳稻恢复系，与BT型不育系测交后代育性较高；改良系与BT型不育系测交F1平均小穗育性较C418提高2%左右，未达显著水平，改良效果不太明显。C418与HL型六千辛A测交F1的小穗育性为74.49%，所有聚合基因的改良系单株测交F1小穗育性平均为91.58%，较C418提高17.09个百分点，并且所有改良系测交后代小穗育性与对照相比均极显著提高(<0.01)；大多数改良系对BT型、HL型粳稻不育系的恢复度相近，其中SL1和SL9对六千辛A测交F1平均小穗育性已超过95%。

由以上两年结果可见，通过聚合6能够改良现有BT型粳稻恢复系对HL型粳稻不育系的恢复力，使相应的配组后代结实率达到可应用水平。

2.4 改良系主要农艺性状表现

2015年冬季海南，在12个BC3F3，55个BC4F2改良株系中，结合田间株型、抽穗期和开花习性等农艺性状目测考查，初步筛选出6株基因型为且农艺性状与对照C418相似的单株；2016年正季扬州，种植6个改良系（编号G1~G6）及对照C418。记载各系的生育期，成熟后取样考查14个主要农艺性状并与C418进行比较分析。

表4 改良系与C418主要农艺性状比较(2016)

*表示与C418在0.05水平上差异显著。穗叶差―剑叶叶尖与穗尖的高度差。

All values are listed as mean±; * means significant difference at 0.05 probability level, respectively. DTH, Days to heading; PH, Plant height; CT, Culm thickness; PNP, Panicle number per plant; CPL, Length of caulis panicle; SNC, Spikelet number of caulis panicle; PBN, Primary rachis branch number; AFL, Angle between flag leaf and caudex; TLL, Length of the 3rd leaf from top; SLL, Length of the 2nd leaf from top; FLL, Length of flag leaf; DPFL, Vertical distance between panicle tip and flag leaf tip; PND, Panicle neck diameter; PCD, Panicle curvature degree.

由表4可以看出，由于上世代是在海南进行的单株选择，两地两季气候差异及各单株的光温反应不同，所选择鉴定的改良系生育期与对照存在较小差异。其他13个农艺性状的考查结果表明，除株系G2在剑叶长度上与C418存在显著差异外，大多数聚合系的农艺性状基本回复到C418的形态，说明本研究分子标记辅助回交育种的效果较好。

3 讨论

生产上，三系杂交粳稻一直以利用BT型不育细胞质为主，细胞质源单一；同时BT型粳稻不育系的花粉在三核期败育，部分不育系的育性不稳定，这些是制约杂交粳稻发展的因素之一。寻求可用于三系杂交粳稻育种的其他细胞质源能有效克服BT型粳稻不育系存在的问题，促进三系杂交粳稻的发展。本课题组经多年研究发现，利用HL型不育胞质来发展三系杂交粳稻是可行的[5-8]。HL型粳稻不育系可以由BT型粳稻保持系转育而成，选育过程较容易。由于HL型不育细胞质主要应用于杂交籼稻中，已选育的恢复系均为籼型恢复系，而现有粳稻恢复系均为BT型恢复系，因而选育HL型粳稻恢复系是实现HL型杂交粳稻生产应用的关键。本课题组为实现HL型不育胞质在三系杂交粳稻中的应用，利用HL型粳稻不育系与BT型粳稻恢复系进行测交，结果表明大多数BT型恢复系仅对HL型粳稻不育系表现出部分恢复的能力[8, 18]，无法应用于生产。因此，基于现有BT型粳稻恢复系来高效选育HL型粳稻恢复系对于实现HL型杂交粳稻生产利用具有十分重要的意义。

BT型粳稻恢复系利用的恢复基因首先是通过“籼粳架桥”技术从籼稻品种IR8中获得，并育成了第一个恢复系C57；在“九五”期间，再次以此方法育成了粳稻恢复系C418[19, 20]。在生产上，全国大量的BT型粳型恢复系均是以C57、C418或其中间材料为亲本培育的。据不完全估计，到20世纪末国内应用的粳稻恢复系60%含有C57的血缘[21]，这造成了BT型粳稻恢复系的恢复基因源十分狭窄。已有遗传分析及BT型育性恢复基因定位结果表明，BT型粳稻恢复系携恢复基因(/)[9,10]，尚无其他恢复基因定位的报道，该结果也验证了BT型粳稻恢复系的恢复基因比较单一。生产上，HL型籼稻不育系恢复谱广，但强恢复系不多，遗传分析发现大多恢复系只带有1对主效恢复基因，并将其定位在第10染色体上，该基因与BT型恢复基因为同一基因[17-19]。尽管在籼稻核背景下，单个()就能够使得HL型籼稻不育系育性恢复正常，但()对HL型粳稻不育系只具有部分恢复力，这也是大多数BT型粳稻恢复系对HL型粳稻不育系恢复度不高的原因[14, 18]。9311为HL型籼稻强恢复系，携带有2对恢复基因和，其配制的杂交籼稻组合花粉恢复度达75%，育性表现稳定[14, 15]。为一个新的恢复基因，位于第8染色体上，在BT型粳稻恢复系中尚未见利用的报道。本研究利用分子标记辅助选择技术，将与进行聚合，共获得67个改良系。测交鉴定表明在现有BT型粳稻恢复系中导入能够显著提高对HL型粳稻不育系的恢复度，并且多数改良系对HL型粳稻不育系的恢复度达到BT型杂交粳稻可应用水平，这表明基于现有BT型粳稻恢复系进行与聚合育种是选育HL型粳稻恢复系的可行途径。

传统的恢复系选育及改良需通过大量测交和育性鉴定来筛选，工作量大。此外，小穗育性受环境因素影响较大，测交F1田间育性鉴定准确性会受到一定的干扰。通过分子标记技术辅助选择，只对目标基因进行选择，无需在每个回交世代进行恢复力鉴定，节省工作量，提高了育种效率。分子标记辅助选择的准确性主要取决于目的基因与连锁标记的紧密程度，所用的选择标记与目的基因连锁越紧密，辅助选择的结果越准确可靠。本研究中所使用的标记RM407与基因紧密连锁，从测交结果来看，分子标记辅助选择获得聚合的单株均能表现出对HL型粳稻不育系较强恢复力，选择的准确度非常高。相关研究结果为今后分子标记辅助选择改良粳稻恢复系的恢复力提供了借鉴。

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Yang Z Y, Chen Q B, Chen R F, Su Z J, Jia B Q, Tong J X, Wang J Q. The breeding ofrice restorer C57., 1981, 7(3): 153-156. (in Chinese with English abstract)

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Zhao Y C, Yang Z Y, Wei Y L, Zhang Z X. A second discussion on development of northernhybrid rice from the successful breeding of restorer C418., 2000(5): 5-6. (in Chinese with English abstract)

Improving the Ability of C418 to Restore the Fertility of the Honglian-type Cytoplasmic Male SterilityLines via Molecular Marker-assisted Selection

ZHANG Honggen, ZHONG Chongyuan, SI Hua, LIU Qiaoquan, GU Minghong, TANG Shuzhu*

(//,,,;*Corresponding author,:)

【Objective】Efficient breeding ofrestorers for Honglian(HL) typecytoplasmic male sterile(CMS) lines is vital to develop HL-typehybrids, which is of great significance for the development of three-linehybrids.【Method】, a fertility restorer gene for HL-type CMS, was identified from ‘9311’, anrestorer for HL-type CMS lines. In our previous study, R1093, a chromosome segment substitution line derived from the cross between the donor parent ‘9311’and the recipient parent ‘Nipponbare’, had been identified to carry. In the present study,was pyramided into C418, a BT-typerestorer only carrying, using backcross via marker-assisted selection, and the restoration ability of the improved lines for BT-, HL-type CMS lines was analyzed by testcrossing.【Result】To 2016, a total of 67 improved lines, including 12 BC3F4lines and 55 BC4F3lines, had been obtained, and most of the agronomic traits were well maintained in six improved lines. The testcrossed F1plants from improved lines and BT-Liuqianxin A exhibited the similar fertility levels with those of the testcrossed F1plants from C418. The significant increased fertility levels were observed on the testcrossed F1plants from improved lines and HL-Liuqianxin A, and most of these testcrossing lines exhibited fertility levels over 85%, indicating these improved lines can be applied to rice production.【Conclusions】The pyramiding ofandcan improve the restoration ability of BT-typerestorer lines to HL-typeCMS lines, which should be an important way to breed HL-typerestorer lines.

; Honglian-type; restorer line; marker-assisted selection

Q755; S511.0351

A

1001-7216(2018)05-0445-08

2017-12-24；

2018-03-01。

国家重点研发计划资助项目 (2016YFD0101107); 国家自然科学基金资助项目(31771743); 江苏高校优势学科建设工程项目。

10.16819/j.1001-7216.2018.7152