一个水稻铜锌SOD酶基因在应答亚砷酸盐胁迫中的作用

窦玲玲 胡海超 马龙 柯笑楠 刘明月 练旺民 金珂 谢玲娟 刘庆坡



一个水稻铜锌SOD酶基因在应答亚砷酸盐胁迫中的作用

窦玲玲 胡海超 马龙 柯笑楠 刘明月 练旺民 金珂 谢玲娟 刘庆坡*

(浙江农林大学 农业与食品科学学院, 杭州 311300；*通讯联系人, E-mail: liuqp@zafu.edu.cn)

【目的】水稻基因编码一个铜锌SOD酶，但其在响应亚砷酸盐[As(Ⅲ)]胁迫中的生物学功能未知。本研究旨在深入揭示由该基因调控水稻砷耐性改变的分子机理并为水稻抗逆育种提供理论参考。【方法】以野生型日本晴(WT)和2个过表达转基因株系为试材，通过胁迫处理、生理指标测定和基因表达分析等，系统探究了转基因植株对As(Ⅲ)的耐受性表现，并初步揭示了其调控水稻砷耐性的生理和分子机理。【结果】与WT相比，过表达转基因株系对As(Ⅲ)更加敏感；转基因植株在砷胁迫下的根系相对伸长量、生物量(干质量)、叶绿素含量、根系细胞质膜完整性、叶片抗氧化程度等均显著低于WT；在砷处理后的WT和转基因植株叶片中的表达模式略有不同，但均表现为处理24 h时被显著诱导表达。【结论】过度表达基因可导致水稻的砷耐受性极显著下降。

水稻；铜锌SOD；亚砷酸盐；转基因；生理机理；基因表达

砷在自然界分布广泛，对动植物和人类具有强烈毒害作用[1]。长期以来，由于含砷农药和化肥等的大量施用，导致受砷污染土壤面积不断增加，污染程度逐年加剧，严重威胁动植物生产和人类健康。据报道，目前全世界范围内有近1.5亿人正遭受慢性砷中毒危害，其中，南亚和东南亚地区包括中国是受砷毒害最为严重的区域之一[2]。水稻是世界约一半人口，尤其东南亚国家的主要粮食作物，但相比于其他旱作禾谷类作物，水稻对砷的吸收与富集能力更强[3]。因此，水稻砷污染已成为世界性环境与卫生问题。

环境中的砷主要以砷酸盐[As(Ⅴ)]的形态进入植物体内，并在砷酸还原酶的催化下还原为亚砷酸盐[As(Ⅲ)]，而As(Ⅲ)再进一步被甲基化或螯合化，其产物随后被转移到液泡中或排出体外，从而达到解毒作用[4]。目前，从水稻基因组中已经克隆到两个砷酸还原酶基因和，其中主要在根系中表达，而在根系和地上部均有表达[5]。Dhankher等[6]发现，拟南芥基因敲除的突变体植株对As(Ⅴ)更加敏感。水稻中，As(Ⅴ)主要通过磷转运通道蛋白被吸收，而As(Ⅲ)则主要通过水通道蛋白超家族中的类Nod26内在膜蛋白，如OsNIP2;1、OsNIP2;2、OsNIP1;1和OsNIP3;2等被吸收和向地上部转移[7-9]，其中OsNIP2;1在As(Ⅲ)进入和排出根部细胞过程中起主导作用[9]。Zhao等[9]发现与对照相比，功能缺失突变体的根系对As(Ⅲ)的吸收可减少57%。另外，As(Ⅲ)可通过硅转运蛋白Lsi2向地上部转移和在籽粒中累积[10]。研究发现，水稻突变体植株地上部的砷富集量比野生型约减少70%[10]。

提高水稻对砷的耐受性是解决水稻砷污染的有效途径之一。Mosa等[11]和Tiwari等[12]在蛙卵细胞和酵母等异源体系中，分别表达水稻基因、、和后发现，这些基因编码的蛋白均可转运As(Ⅲ)，而且在拟南芥中过量表达相关基因后均显著增强了转基因植株对砷的耐受性。近年来，不同研究组利用过表达和/或敲除基因功能等转基因技术发现，[13]、[14]和[15]在水稻As(Ⅴ)吸收、积累和耐受性方面发挥着重要作用。此外，过表达miR528和miR3979可显著改变水稻对As(Ⅲ)的耐受性[16,17]。这表明miRNA同蛋白编码基因一样在水稻应答砷胁迫中起着重要的调控作用。

植物基因组中编码多个抗氧化酶基因，其中，超氧化物歧化酶(SOD)负责清除逆境胁迫下产生的超氧自由基，进而在植物应答逆境胁迫和衰老过程中发挥作用[18]。水稻基因编码一个铜锌SOD酶, 1997年已克隆[19]。1999年，Kaminaka等[20]进一步研究发现，在光照条件下水稻铜锌SOD酶可对盐害胁迫做出快速响应。但该基因是否参与水稻砷胁迫应答尚不清楚。因此，本研究获得了基因的过表达转基因植株，通过分析其在正常和As(Ⅲ)处理后的表型、生理生化指标变化及其时空表达模式等，明确了该基因在水稻应答As(Ⅲ)胁迫中的作用。这对于深入阐明水稻砷耐受性的内在分子机理具有重要意义，同时也可为水稻抗逆育种或品种改良提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料与处理

以粳稻品种日本晴(WT)和过表达转基因株系(OE-44770-4、OE-44770-13；日本晴为背景材料)为试材。分别选取一定数量健康饱满的种子，先用0.5%次氯酸钠溶液消毒15 min后，用纯净水漂洗3~5次，并在蒸馏水中浸泡24 h。然后，将浸泡好的种子转移到覆有滤纸的发芽盒中，添加适量0.5%氯化钙溶液，置于光照培养箱中催芽。培养条件设置为30℃光照16 h/25℃黑暗8 h。待苗长4 cm时，挑选长势一致的幼苗移植到培养器皿中进行水培[营养液配方如下：0.091 mmol/L KNO3、0.183 mmol/L Ca(NO3)2、0.274 mmol/L MgSO4、0.1 mmol/L KH2PO4、0.183 mmol/L (NH4)2SO4、0.5 µmol/L MnCl2、3 µmol/L H3BO3、0.1 µmol/L (NH4)6Mo7O24、0.4 µmol/L ZnSO4、0.2 µmol/L CuSO4、40 µmol/L NaFe(Ⅲ)-EDTA和2 mmol/L 2-吗啉磺酸，调节pH至5.5]，期间每3 d更换一次营养液。每皿8株。实验设对照(CK)和As(Ⅲ)胁迫两种处理，每个处理设置3次重复。待苗龄21 d时，利用25 µmol/L亚砷酸钠进行胁迫处理。

表1 定量RT-PCR所需引物

1.2 转基因植株的获得及阳性检测

利用正向(5′-ATGCAAGCCATCCTCGCCGCT G-3′)和反向引物(5′-CTACAACGGGGTCAGCCC AACAA-3′)从日本晴基因组中扩增出基因的编码区序列(CDS)。PCR扩增产物经HⅠ和Ⅰ双酶切后，连接至同样经过上述双酶切的pCAMBIA1300-UBI载体上，然后采用热激法将连接产物转化到大肠杆菌DH5α。最后，将目的基因经农杆菌介导侵染日本晴愈伤组织，经潮霉素抗性筛选后获得转基因植株。

采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法[21]提取水稻基因组DNA，然后利用基因特异引物(5′-GCT TCCACCTCCACGAGTTT-3′和5′-AGACCGGCA ACAGGATTCAATC-3′)进行转基因植株的阳性检测。PCR程序如下94℃下预变性5 min；94℃下变性30 s，60℃下退火30 s，72℃下延伸30 s，35个循环；72℃下延伸7 min。

1.3 生理指标的测定

1.3.1 根系相对伸长量

在As(Ⅲ)处理前，对各供试水稻幼苗的根长进行测定，同时做好标记。在处理6 d时，再次测定根长，并根据标记计算其根系的相对伸长量。

1.3.2 生物量(干质量)

在胁迫处理6 d时，将处理后的水稻幼苗放到解析液中浸泡10 min，将残留水分擦干后置于烘箱中先105℃下杀青30 min，后75℃下干燥48 h。使用分析天平测定各供试植株的干质量。

1.3.3 叶绿素含量

胁迫处理6 d时，称取各供试材料的叶片0.1 g，剪成1 cm大小后加入体积比为1∶1的乙醇、丙酮混合液，避光萃取保存24 h。期间每隔3~4 h摇晃一次，直至叶片完全失色。然后用分光光度计分别测定663、645、470 nm处的吸光值。

1.3.4 根尖细胞质膜的完整性

亚砷酸盐处理6 d后，收获各供试材料的根系，将其置于0.5 mmol/L CaCl2溶液(pH 4.5)中浸泡5 min。用纯水洗涤、吸干后，将其浸没在4 mL的伊文思蓝溶液[0.025%(/)的伊文思蓝溶于100 µmol/L CaCl2中，调节pH至5.6]中染色1 h。用蒸馏水冲洗15 min后观察染色情况并拍照。

1.3.5 氯化硝基四氮唑蓝液(NBT)染色

选取As(Ⅲ)处理6 d后的各个材料相同部位的叶片若干(≥3)，将叶片浸没在1 mg/mL 氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染液中于光下染色，直至有明显的表型出现。然后将叶片转移至乙醇中，70℃水浴处理直到叶片脱色至黄白色结束。脱色完成后的叶片保存于70%酒精中，然后放置于体式显微镜(型号为SZX10，OLYMPUS公司)下观察染色情况并拍照。

1.4 基因表达分析

采用Trizol法提取水稻叶片总RNA，使用Invitrogen反转录试剂盒(Invitrogen Superscript Ⅲ first-strand synthesis system)将RNA反转录成cDNA，然后在Bio-Rad公司的CFX-connect 荧光定量PCR仪上进行扩增，反应体系包括2.0 µL cDNA，正反向引物各1.0 µL(表1)，12.5 µL SYBR Premix ExⅡ和12.5 µL ddH2O。PCR程序如下：先95℃下预变性5 s，95℃下变性5 s，然后60℃下复性30 s，40个循环。以基因作内参，采用2−法计算基因的相对表达量。

1.5 统计分析

所有数据均为≥3次或8次重复的平均值±标准误。利用SPSS 22.0进行统计分析。采用最小显著性差异法(LSD)进行方差分析，在5%水平上分析不同材料及不同处理间的差异显著水平。

2 结果与分析

2.1 转基因植株的阳性检测

采用农杆菌介导法获得13个基因的过表达转基因株系，随后利用基因特异引物对T1代650个转基因植株进行PCR检测，共鉴定到520个阳性植株，阳性率为80%(图1)。

M－DNA标记 2000; 1－阳性对照；2, 3, 5~7, 9~12, 14, 15, 19, 21, 23, 24为转基因阳性植株；4, 8, 13, 16~18, 20, 22为转基因阴性植株。

Fig. 1. PCR analysis of transgenic rice plants carrying overexpressed

2.2 Os08g44770.1在各转基因株系中的表达分析

采用定量RT-PCR分析了基因在WT及各转基因株系(OE-44770)的15 d龄水稻幼苗叶片中的表达情况。从图2可以看出，在正常生长条件下，与WT相比，在各个过表达转基因株系叶片中的表达量均显著升高(>20倍)。综合考虑目标基因在各转基因株系中的表达水平以及收获的各株系的种子量，选择OE-44770-4和OE-44770-13株系用于下一步研究。

2.3 转基因水稻的砷耐受性分析

从图3可以看出，与WT相比，在25 μmol/L As(Ⅲ)处理3 d时，OE-44770转基因植株的叶片出现了明显的卷曲现象，而且较低叶位的叶片已经开始逐渐黄化(图3-A)。随着As(Ⅲ)处理时间的延长(6 d)，其叶片卷曲程度明显加剧，黄化叶片数量也逐渐增多，同时较高叶位的叶片也开始出现黄化(图3-B)。这表明基因过量表达后显著增加了转基因水稻对亚砷酸盐的敏感性。

2.4 亚砷酸盐对供试材料各生理指标的影响

2.4.1 对生物量(干质量)的影响

与各供试材料的对照相比，在As(Ⅲ)处理6 d时，WT和各转基因株系的干质量均显著下降(图4)。OE-44770-4和OE-44770-13株系的平均降幅(分别减少39.15%和31.21%)远大于WT(12.53%)。

2.4.2 对根系相对伸长量的影响

从图5可以看出，在25 µmol/L亚砷酸盐胁迫处理6 d时，各供试水稻根系的伸长量均受到不同程度的抑制。但是，WT的受抑制程度(47.08%)明显小于2个转基因株系OE-44770-4和OE-44770-13(71.75%和65.4%)。因为砷胁迫下根系的相对伸长量是衡量水稻砷耐受性的重要指标，所以过表达后确实显著降低了转基因水稻对亚砷酸盐的耐受性。

图2 WT和各转基因株系叶片中Os08g44770.1的表达量

Fig. 2. Expression level ofgene in the leaves of wild type(WT) and transgenic rice lines.

图3 亚砷酸盐处理3 d和6 d后野生型(WT)和两个转基因株系的表型

Fig. 3. Comparison of phenotypes of WT and transgenic rice plants after As(Ⅲ) treatment for 3 and 6 days.

相同小写字母表示不同材料不同处理间差异未达0.05显著水平。

Fig. 4. Comparison of biomass of WT and transgenic rice plants after 6-day As(Ⅲ) treatment(=8).

相同小写字母表示不同材料不同处理间差异未达0.05显著水平。

Fig. 5. Comparison of relative root elongation of WT and transgenic rice plants under As(Ⅲ) stress for 6 days (=8).

2.4.3 对叶绿素含量的影响

亚砷酸盐对植物的毒害作用主要表现为叶片卷曲、黄化并逐渐死亡，而叶片的黄化主要因为绿色素含量发生改变所致[22]。从表2可以看出，与CK相比，As(Ⅲ)处理下，各供试水稻的叶绿素 a、叶绿素b、总叶绿素以及类胡萝卜素的含量均出现不同程度的降低，但多数指标的含量均与CK未达显著差异。不过在砷处理下，OE-44770转基因株系的叶绿素a以及总叶绿素含量显著低于WT(表2)。

表2 亚砷酸盐对WT和各转基因材料叶绿素含量的影响

同列数据后跟相同小写字母者表示不同材料不同处理间差异未达0.05显著水平。

Data followed by the common letters within a column indicate no significant difference among the treatments or the materials (≤0.05).

2.4.4 对根尖细胞质膜透性的影响

植物在逆境条件下细胞会受到不同程度损伤，但受伤害程度会因植株自身抗性和逆境条件而产生差异[23]。我们采用伊文思蓝染色法鉴定各供试材料根系细胞在As(Ⅲ)胁迫下的受损程度，因为正常的细胞膜不会吸收或吸收很少的伊文思蓝，但当细胞膜受损后，伊文思蓝会进入细胞，使它呈现蓝色。细胞膜受到损伤越大，伊文思蓝进入细胞越多，染色程度越深。从图6可见，在As(Ⅲ)处理6 d后，2个转基因株系根系染色程度远深于WT，表明其根系细胞的受损程度较大。

2.4.5 对叶片活性氧平衡变化的影响

在逆境胁迫条件下，植物体内会产生大量的O2−∙、∙OH、H2O2等活性氧自由基。这些自由基具有很强的氧化活性，能够破坏植物体内的氧化还原平衡，从而对植物造成伤害[24]。NBT会被超氧阴离子氧化而还原成蓝色沉淀。因此，通过NBT染色可推断出各供试材料所受的氧化胁迫程度。从图7可以看出，在As(III)胁迫处理下，各供试水稻的叶片均存在不同程度的蓝色沉淀。但是WT叶片出现的沉淀较少，而OE-44770的颜色程度较深且染色范围较广，表明在亚砷酸盐处理后转基因材料比WT受到了更强的过氧化胁迫。

2.4 各供试水稻中Os08g44770.1基因的表达模式

在亚砷酸盐处理的不同时间点(0、6、24、72、144 h)，在WT和转基因植株叶片中的表达模式略有差异：其在WT中的表达量呈现先上升(0~24 h)后下降再上升的趋势，而且在胁迫24 h时表达量达到最高，但随着处理时间的延长，其表达量出现下降(72 h)，但在胁迫144 h时又出现上调；而在转基因材料中，的表达趋势表现为处理6 h时下降，但在胁迫24 h时达到最大值，随后在72 h时表达水平急剧下降，不过在处理6 d时其表达量又出现反弹(图8)。另外，我们发现，在转基因植株根系中该基因具有与其在叶片中相似的表达模式(数据未提供)。

图6 亚砷酸盐处理后WT和各转基因株系根尖细胞质膜透性比较

Fig. 6. Comparison of plasma membrane integrity of WT and transgenic rice plants after As(Ⅲ) treatment.

图7 亚砷酸盐处理后WT和各转基因株系叶片活性氧平衡变化的比较

Fig. 7. Comparison of reactive oxygen balance in the leaves of WT and transgenic rice plants under As(Ⅲ) stress.

图8 亚砷酸盐处理后Os08g44770.1在WT和转基因植株叶片中的表达变化

Fig. 8. Temporal expression profiles ofin the leaves of As(Ⅲ)-treated WT and transgenic rice plants.

3 讨论

目前，有关水稻砷耐性相关蛋白编码基因和调控性miRNA的鉴定及其应答As(Ⅴ)或As(Ⅲ)胁迫的分子机制研究等方面取得了一定进展[11-17]。Liu等[16]发现，miR528可负调控水稻对As(Ⅲ)的耐受性。生物信息学和烟草叶片转染等进一步表明，是miR528的靶基因。那么，miR528是否通过与基因互作进而调控水稻对As(Ⅲ)胁迫做出应答呢？我们采用过表达转基因策略证明也负向调控水稻的砷耐受性(图3)。miR528与在调控水稻砷耐受性改变方面的作用机理有待进一步深入探究。

植物在进化过程中，衍生出通过调节抗氧化酶系活性等机制以响应外界逆境胁迫[25]。在抗氧化酶系统中，超氧化物歧化酶(SOD)可有效清除植物在逆境胁迫下细胞内产生的自由基，将其转化成过氧化氢，而后进一步在CAT、APX等作用下将其分解成分子氧和水，使得植物免受或减少胁迫伤害[26]。Tripathi等[27]和张丽清等[17]发现，耐砷水稻在砷胁迫下其植株内SOD等抗氧化酶活性明显上调，而在砷敏感材料中的活性显著下降，表明该酶的活性与植物的抗逆能力呈现一定正相关。本研究发现，基因在WT(耐砷品种)砷胁迫24 h时被显著诱导表达；该基因在过表达转基因植株砷处理不同时间也强烈上调表达(远高于其在WT中的表达水平)，但转基因植株却表现为对砷耐性显著减弱。因此，推测当SOD酶活性达到一定水平时，植物通过启动其抗氧化防御系统以应对逆境胁迫[28]，但当SOD酶基因被过度超量表达后，可能会破坏植物抗氧化防御系统平衡，从而产生相反效应而使植物受到毒害。

根系是植物感受外界逆境胁迫的初始部位，其生理状况直接影响到植物的生长发育及其耐受性[29]。重金属胁迫下，植物通过根系吸收污染物并向地上部运输、转运，当污染物积累到一定程度时，植物就会出现中毒症状。研究发现，植物的根系相对伸长量可直接反映其抗逆能力。在高浓度硒胁迫下，彩叶草幼苗的根系相对伸长量明显低于对照[30]。在逆境胁迫下，植物体内的活性氧自由基含量会增加，导致根系膜质过氧化程度加剧以及叶片活性氧代谢失衡[31]。本研究发现，过表达转基因株系对亚砷酸盐的耐受性下降，而且其根系的相对伸长量、根系细胞膜完整性、叶片抗氧化程度等均显著弱于WT。表明亚砷酸盐胁迫会破坏转基因植株的根系细胞结构，进而影响植株的生长发育进程，致使叶片发黄，植株长势变弱，甚至死亡。这与常思敏等[32]的研究结果一致。

生物量是植物响应逆境胁迫的综合反应。在逆境胁迫下，植物所受胁迫程度越高，受抑制现象越明显，植物生长发育越缓慢[33]。本研究发现，随着砷处理时间延长，各供试材料的生物量(干质量)均显著低于CK，而且转基因植株的生物量明显低于WT，表明基因被过表达后，水稻对亚砷酸盐的敏感程度加剧。另外，植物叶片中叶绿素的含量直接影响其光合作用效率[34]。研究发现，在逆境胁迫下，叶绿素含量越低，相应植株的耐受性越低[35]。本研究中，砷胁迫下，过表达转基因株系的叶绿素含量降低，而且其叶片的黄化程度也比CK严重。因此，可以推测被超量表达后可能导致植株内产生严重过氧化胁迫而致使细胞质膜通透性增大并伴随大分子物质损失[27]，进而造成转基因植株的砷耐受性变弱。

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Functional Analysis of a Copper/Zinc SOD Encoding Gene in Response to Arsenite Stress in Rice

DOU Lingling, HU Haichao, MA Long, KE Xiaonan, LIU Mingyue, LIAN Wangmin, JIN Ke, XIE Lingjuan, LIU Qingpo*

(,;*Corresponding author, E-mail: liuqp@zafu.edu.cn)

【Objective】encodes a Cu/Zn-SOD protein in rice, but its biological function in response to arsenite [As(Ⅲ)] remains unclear. The results presented here would be intriguing for further investigating the molecular mechanisms of-mediated arsenic tolerance in rice, and also providing useful new idea for rice stress resistance breeding. 【Methods】Using wild type(WT) Nipponbare and two transgenic rice lines overexpressingas materials, we investigated the phenotypes of WT and transgenic plants after exposure to As(Ⅲ), and further uncovered its physiological and molecular mechanisms in regulation of As(Ⅲ) tolerance in rice through stress treatment, physiological index measurement, and gene expression analysis, etc. 【Result】The results showed that, compared with WT, transgenic rice plants were more sensitive to As(Ⅲ) stress; Under As(Ⅲ) exposure, transgenic plants showed shorter relative root elongation, lower biomass (dry weight) and chlorophyll content, as well as lower root cell membrane integrity and antioxidant abilities in leaves. Moreover,exhibited slightly different expression patterns but both showing expression peak at 24 h after As(Ⅲ) treatment in leaves of WT and transgenic plants. 【Conclusion】Strong overexpression ofin rice would result in its hypersensitivity to arsenite stress.

rice; Cu/Zn SOD; arsenite; transgenic; physiological mechanism; gene expression

Q786; Q945.78; S511.034

A

1001-7216(2018)05-0437-08

10.16819/j.1001-7216.2018.7154

2017-12-25;

2018-02-01。

国家自然科学基金资助项目(31471431)；浙江农林大学“青年拔尖人才”计划资助项目；浙江农林大学学生科研训练项目(2013200014, 2013200037, 2013200056)。