植物乳杆菌HN1发酵对番石榴多酚的影响

2018-09-20 03:51李晓乐杨瑞丽张玉莹豆荣李武
食品研究与开发 2018年19期
关键词:果浆番石榴巴氏

李晓乐,杨瑞丽,张玉莹,豆荣,李武,*

(1.海南大学食品学院,海南海口570100;2.广东省食品质量安全重点实验室/华南农业大学食品学院,广东广州510642)

多酚是一类广泛存在于植物中的具有多元酚结构的化合物,按其结构又可分为酚酸类、黄酮类、芪类和木质素四类[1]。研究表明,多酚具有抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤等多种生物活性[2-4]。茶多酚、苹果多酚、葡萄多酚等一些酚类物质已被用于功能性食品的开发和相关临床研究。

果蔬是人体膳食摄入多酚类物质的主要来源,尽管酚类物质在果蔬中分布较为广泛,但一些酚类化合物的生物利用度非常低[5]。Scalbert等[6]研究发现,人体摄入10 mg~100 mg单一酚类物质,多数酚类物质的血浆浓度都低于1 μmol/L。同时研究显示,酚类物质的生物利用度与其结构、食品加工因素等密切相关[7]。Manach等[8]对18种主要膳食酚类物质的研究显示,不同酚类物质的生物利用度差异极其显著,其中没食子酸和异黄酮最易被机体吸收,其次为儿茶素、黄烷酮类和槲皮素糖苷。

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是乳酸菌的一种,其在蔬菜和水果表皮分布广泛。研究发现,多种植物乳杆菌具有转化多酚的能力[9-11]。Ciafardini等[12]发现,植物乳杆菌B17、B20、B21可以将橄榄苦苷降解为羟基酪醇和榄香醇酸,将咖啡酸降解为乙烯基儿茶酚和乙基儿茶酚。最近的研究显示,利用植物乳杆菌发酵果蔬,可以改变其多酚的组成、提高其抗氧化活性,改善其酚类生物利用度[13]。

番石榴是一种富含多酚的水果,除鲜食外,常用于饮料、果酱等加工[14]。研究显示,番石榴多酚具有抗肿瘤、降低细胞氧化损伤等多种活性[15]。前期的研究显示,番石榴鲜果中主要含有表儿茶酸、槲皮素、异香草酸、对香豆酸、咖啡酸等酚类物质[16-17]。但是,目前对于番石榴多酚在加工过程中的变化的研究报道还较少。

从香蕉茎叶上分离到1株植物乳杆菌HN1(Lactobacillus plantarum HN1),其具有良好的益生作用和改善青储饲料品质及转化多酚的能力[18]。本文采用HN1发酵番石榴果浆,分析其酚类物质和抗氧化活性在发酵及巴氏杀菌工艺过程中的变化,为番石榴加工产品的开发利用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

番石榴(品种珍珠):海南省海口市南国超市。

没食子酸、芦丁、水溶性维生素E(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid,Trolox)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt,ABTS)、2,4,6-三吡啶基三嗪:Sigma-Aldrich公司;甲醇、乙腈(色谱级):Tedia公司;其他试剂(分析纯):广州化学试剂厂。

1.2 方法

1.2.1 番石榴果浆发酵

鲜果用自来水清洗干净,再用蒸馏水冲洗2遍。按10∶1(g/mL)的比例加入蒸馏水打浆,巴氏杀菌(65℃,30 min)后快速冷却至室温,在无菌条件下接种3.0%植物乳杆菌HN1,混匀,37℃发酵8 h,以不接菌种的果浆作为对照。番石榴果浆的起始pH值为4.2±0.04,8 h发酵结束后pH值为3.78±0.05,活菌数为1.60×107cfu/mL。

1.2.2 游离酚提取

游离酚提取参照Wolfe等[19]的方法:挑选成熟度一致水果,自来水洗净后用蒸馏水冲洗一遍。取水果可食用部分,25 g(3个平行)加入100 mL预冷的80%丙酮,均质机提取 6 min(3.0 min×2 停顿 30 s),纱布过滤,果渣复提1次,合并滤液,45℃真空浓缩后用蒸馏水定容至25 mL,-80℃冰箱保存待测。

1.2.3 结合酚提取

结合酚的提取采用NaOH消化法,参照曹双等[19]的方法。将1.2.2中提取残渣用双蒸水除去有机试剂,加入4 mol/L NaOH(1 g∶15 mL),室温磁力搅拌提取2.0 h后用4 mol/L盐酸调整pH值至2.0。乙酸乙酯萃取5次,合并萃取液,45℃旋转蒸发至干,用甲醇定容后储存于-80℃冰箱待测。

1.2.4 多酚含量的测定

参照Wolfe等[20]的方法,取125 μL稀释至一定浓度的提取物,加入0.5 mL去离子水和125 μL的Folin-Ciocalteu试剂,混匀后反应6 min,再加入1.25 mL 7%Na2CO3溶液和1 mL蒸馏水,混匀,避光反应90 min后于760 nm测定其吸光值,空白使用125 μL溶剂代替提取物。结果以每100克新鲜果肉所含的没食子酸当量表示(mg GAE/100g FW)。

1.2.5 黄酮含量的测定

总黄酮含量的测定参考Dewanto等[21]的方法并稍作改进。300 μL酚类物质提取物加入1.5 mL蒸馏水和90 μL 5%的亚硝酸钠溶液,反应6 min后加入180 μL 10%的AlCl3·6H2O溶液,5 min后加入0.6 mL 1 mol/L的NaOH溶液,最后用蒸馏水补足至3 mL,于510 nm下测定其吸光值。总黄酮含量结果以每100克鲜果肉中所含的芦丁当量(rutin equivalent,RE)表示,单位为mg RE/100 g,试验3次重复。

1.2.6 ABTS+·清除能力

采用张金宏[22]的方法。配制7.0 mmol/L ABTS储备液,140 mmol/L K2S2O8溶液。取5 mL 7 mmol/L ABTS溶液与88 μL 140 mmol/L K2S2O8溶液于离心管中,混匀,室温下避光反应12 h即为ABTS工作液(现配现用),将ABTS工作液在734 nm处的吸光度用无水乙醇调整到0.700±0.020后备用。取25 μL稀释至一定浓度的样品加入2 mL ABTS工作液,混匀后室温避光反应6 min,于734 nm处测定吸光值。结果以每100克鲜重中Trolox当量(μmol TE/100g FW)表示。

1.2.7 铁离子还原法(ferric ion reducing antioxidant power,FRAP)抗氧化能力测定

采用 Thai等[23]的方法,2 800 μL FRAP 工作液(300 mmol/L醋酸缓冲液,10 mmol/L的TPTZ,20 mmol/L的FeCl3溶液按体积比10∶1∶1混合均匀)中加入200 μL相应水果提取液或其稀释液,37℃避光反应30 min,593 nm测定其吸光值。各提取物的总抗氧化能力以Trolox为标准进行定量,结果以每100克新鲜果肉中所含的Trolox当量(TE)表示(μmol TE/100 g)。

1.2.8 超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用(ultra-performance liquid chromatography-quadrupoletime of flight mass spectrometry,UPLC-Q-TOF-MS/MS)条件

Agilent 1290-6540超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用仪(UPLC-Q-TOF-MS/MS)。色谱条件为流动相A:乙腈;流动相B:0.15%甲酸水溶液;洗脱梯度:1 min~6 min,10%~20%A;6 min~10 min,20%~25%A;15 min~20 min,60%~95%A;20 min~25 min,95%A;流速:0.5 mL/min;二极管阵列检测器(diode array deterctor,DAD),DAD 检测波长:200 nm~400 nm;进样体积:20 μL;柱温:30 ℃。

质谱条件为毛细管电压:3.5 kV,片段电压:130 V;雾化电压:241.33×103Pa,干燥气体温度:325℃,气体流速:9 L/min,离子源为电喷雾离子化源(electron spray ionization,ESI),负离子模式扫描,质量数扫描范围 m/z 100~1 700。

1.2.9 数据统计分析

数据结果以平均值±标准差表示,实验数据的显著性检验运用DPS统计软件的ANOVA(以p<0.05为差异显著)进行分析。

2 结果与分析

2.1 巴氏杀菌和发酵前后总酚和黄酮含量的变化

巴氏杀菌和发酵对番石榴果浆中游离酚、结合酚和黄酮含量的影响见图1。

图1 巴氏杀菌和发酵对番石榴果浆中游离酚、结合酚和黄酮含量的影响Fig.1 Effect on the content of free phenolic,bound phenolic and flavonoids in guava pulp of pasterization and fermentation

鲜果中的游离酚、结合酚的含量分别为(227.32±2.14)、(15.26 ± 0.77)mg GAE/100 g FW。经巴氏杀菌后,游离酚和结合酚显著地下降了20.97%和47.51%(p<0.05),分别为(179.66±3.03)、(8.01±2.06)mg GAE/100 g FW。发酵后,游离酚和结合酚分别下降6.81%和55.31%(p<0.05),分别为(167.42± 1.51)、(3.58±0.61)mg GAE/100 g FW。结合酚显著下降的百分比是游离酚的8.12倍,可能是由于植物乳杆菌HN1将番石榴中的结合酚降解为游离酚所引起,而游离酚在整个代谢过程中也会被植物乳杆菌HN1降解为其他物质,因此,发酵后游离酚仅下降了6.81%。

鲜果中的黄酮含量为(274.09±3.04)mgTE/100gFW,巴氏杀菌后,降低为(182.99±2.09)mg TE/100 g FW,较鲜果显著(p<0.05)下降了33.24%。发酵后降低为(144.55±1.17)mg TE/100 g FW,较巴氏杀菌后显著(p<0.05)下降了21.01%。

研究显示,随着巴氏杀菌的温度的提高,果汁中的总酚含量呈下降趋势,在温度为90℃和100℃时,总酚含量呈现先下降后上升的趋势[24]。本文的结果显示65℃30 min杀菌处理后,番石榴果浆的总酚含量显著下降,与前期的结果相类似。

2.2 巴氏杀菌和发酵前后抗氧化活性的变化

巴氏杀菌和发酵对番石榴果浆抗氧化活性的影响见图2。

图2 巴氏杀菌和发酵对番石榴果浆抗氧化活性的影响Fig.2 Effect on antioxidant activity in guava pulp of pasteurization and fermentation

鲜果的FRAP抗氧化值为(1193.10±12.24)μmolTE/100gFW,经巴氏杀菌后,降低为(901.90±55.82)μmolTE/100 g FW,较鲜果显著(p<0.05)下降了24.41%。但发酵后无显著性变化(883.93±15.51 μmol TE/100g FW)。

鲜果的 ABTS+·抗氧化值为(1 483.08±21.43)μmol TE/100gFW,经巴氏杀菌后,降低为(1368.63±30.23)μmol TE/100 g FW,较鲜果显著(p<0.05)下降了 7.72%。发酵后,ABTS+·抗氧化值为(1 432.69±17.93)μmol TE/100 g FW,与鲜果相比无显著(p>0.05)差异。发酵过程中,结合酚含量显著下降,而两种抗氧化活性无显著变化,这说明酚类物质的代谢物具有更强的抗氧化活性,而这一结果与Sun等[25]研究相似。

2.3 发酵过程中酚类物质的分析

根据UPLC-Q-Tof-MS/MS化合物的保留时间、精确质量数、丰度信息,通过Mass Hunter软件匹配所建的数据库(Metlin离线数据库)和文献比对,对番石榴果浆在发酵过程中的酚类物质进行分析鉴定,共发现9种主要酚类物质,如表1所示。

表1 番石榴果浆在发酵过程中的主要酚类物质Table 1 The main phenolic substance in the fermentation of guava pulp

化合物1~9为在番石榴鲜果中检测到的主要酚类物质,其中Díaz等[26]曾报道番石榴叶中存在槲皮素-没食子酰基己糖苷异构体(Quercetin-galloylhexoside Isomer)、金丝桃甙 (Hyperin)、Guavinoside B 和2,6-二羟基-3-甲基-4-O-(6″-O-没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-苯甲酮(2,6-dihydroxy-3-methyl-4-O-(6″-O-galloyl-β-D-glucopyranosyl)-benzophenone)4种多酚物质,本文发现的其他5种化合物在番石榴中首次报道。

巴氏杀菌对多酚的组成有较大的影响,可以使酚类物质发生氧化降解、分解转化或与多糖等大分子形成复杂化合物[26,33]。巴氏杀菌后,化合物 1、2、4、7 未被检测到,可能由于其被氧化降解或与多糖等形成复杂的化合物。同时一级质谱分析的结果显示(见表2),巴氏杀菌后,产生了没食子酸(Gallic acid)、2',4',6'-三乙酰基黄豆黄苷(2',4',6'-Triacetylglycitin)、二氢异甘草素(Davidigenin)、山奈酚 7-木糖苷(Kaempferol 7-xyloside)、(8R,8'R)-开环异落叶松脂素 9-葡萄糖苷((8R,8'R)-Secoisolariciresinol 9-glucoside) 等 5 种多酚类物质,其可能由其他酚类物质降解产生。

表2 巴氏杀菌后产生的酚类物质Table 2 The phenolic substance appear after pasteurization

研究显示,乳酸菌在发酵过程中可以通过β-葡萄糖苷酶、对香豆酸脱羧酶和普通脱羧酶作用,将复杂的酚类物质代谢为小分子酚酸或其他酚类物质[9]。本文的结果显示,化合物4和7在巴氏杀菌后消失,而在发酵后又被检测到。其可能是由其他酚类物质经HN1生物转化或分解产生。同时一级质谱的结果显示(见表3),发酵后产生的2-羟基苯乙酮(2-hydroxyacetophenone) 和 3'-葡萄糖基-2',4',6'-三羟基苯乙酮(3'-glucosyl-2',4',6'-trihydroxyacetophenone) 两种酚类物质,依据其结构推测为多酚的发酵代谢产物。同时,在发酵后的果浆中还检测到白当归素(Byakangelicin)、(+)异豆素(Isoduartin)等几种活性物质。其中,白当归素具有较强的抗氧化活性和保护肾上皮细胞的作用[33];(+)异豆素具有良好的抗肿瘤活性[33]。

表3 发酵后产生的酚类物质Table 3 The phenolic substances appear after fermentation

3 结论

番石榴果浆在巴氏杀菌前、后以及发酵后的游离酚含量依次为(227.32±2.14)、(179.66±3.03)、(167.42±1.51)mg GAE/100 g FW;结合酚的含量依次为(15.26±0.77)、(8.01±2.06)、(3.58 ± 0.61)mg GAE/100 g FW;黄酮含量依次为(274.09±3.04)、(182.99±2.09)、(144.55±1.17)mgTE/100gFW;FRAP抗氧化值依次为(1193.10±12.24)、(901.90±55.82)、(883.93±15.51)μmol TE/100 g FW;ABTS+·抗氧化值依次为(1483.08±21.43)、(1368.63±30.23)、(1 432.69±17.93)μmol TE/100 g FW;番石榴鲜果中主要含有槲皮素-没食子酰基己糖苷异构体、金丝桃甙、Z-astringin、Guavinoside B、异大黄甙、短叶松素、槐异二氢黄酮D、Dorsilurin B和2,6-二羟基-3-甲基-O-(6'-O-没食子酰基-β-D吡喃葡萄糖基)-苯甲酮9种酚类物质;巴氏杀菌后新产生没食子酸、2',4',6'-三乙酰基黄豆黄苷、二羟苯基羟基丙酮、山奈酚7-木糖苷、(8R,8'R)-开环异落叶松脂素9-葡萄糖甙酚类物质;发酵后新产生2-羟苯乙酮和3’-葡萄糖基-2',4',6'-三羟基苯乙酮两种酚类物质;同时番石榴经HN1发酵后产生白当归素和(+)异豆素等生物活性物质。

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