籽瓜瓤提取物对酪氨酸酶抑制作用及其成分分析

2018-09-20 03:51王磊阿地里江阿不都拉张富春刘军
食品研究与开发 2018年19期
关键词:瓜瓤冻干粉提物

王磊,阿地里江·阿不都拉,张富春,刘军

(新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程重点实验室,新疆乌鲁木齐830046)

籽瓜(Citrullus lanatus ssp.vulgaris var.Megalaspermus Lin et Chao)属葫芦科西瓜属,普通西瓜的变种,主要产于中国,分布于新疆、甘肃、内蒙古、青海等地[1-2]。新疆是籽瓜最大的种植区,是农户增收的重要经济作物之一[3-4],仅2015年新疆籽瓜种植就有600万亩[5-6]。籽瓜中含有丰富的维生素、多糖、果胶、L-瓜氨酸等具有保健及抗衰老,增强免疫力的有效成分。除此之外,籽瓜作为抗炎消暑品食用时,由于其含糖量低,适合高血压、糖尿病、高血脂等人群,具有重要的开发价值[7]。但目前大量籽瓜均用于取籽,而剩余的95%左右的瓜瓤往往被废弃,造成了很大的资源浪费和环境污染[8]。虽然有部分研究基于籽瓜活性成分已进行,但其综合利用率依然很低;籽瓜对酪氨酸酶抑制性的相关研究却鲜有报道,故我们对其不同极性及不同制备方式提取物进行酪氨酸酶活性抑制筛选,并对活性成分进行分析,以期增加籽瓜综合利用价值和附加产值。

酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)是一种普遍存在于动物、植物、微生物和人体中的一种含铜离子的多酚氧化酶类,是定位于黑色素细胞中黑色素小体膜上的一种糖蛋白,主要负责外观颜色[9-11]。在紫外线的照射下酪氨酸酶在特化的细胞器黑色素小体内发生系列复杂的反应将底物L-酪氨酸催化生成黑色素,黑色素转移至邻近角质细胞沉着后,呈现颜色[12-14]。酪氨酸酶作为黑色素生物合成中至关重要的酶,通常作为退黑剂的靶标[15]。在过去的50年中,氢醌一直是治疗色素沉着紊乱造成的雀斑、黑斑等皮肤疾病的黄金标准[16],随后又衍生出曲酸[17]、熊果苷、对苯二酚、壬二酸[18]等酪氨酸酶抑制剂的应用。近年对天然活性成分筛选酪氨酸酶抑制剂的研究成为热点,因此籽瓜作为新疆的大宗农作物,进行相关研究十分必要。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

籽瓜材料,2016年9月采集于新疆省阜康市上户沟乡。

L-酪氨酸、酪氨酸酶、熊果苷:北京索莱宝科技有限公司;无水乙醇、二甲基亚砜:天津永晟精细化工有限公司;磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、浓硫酸、醋酐:天津市化学试剂三厂;3,5-二硝基苯甲酸、冰醋酸、香草醛:天津市光复精细化工研究所;碱式乙酸铅:洛阳市化学试剂厂;以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FreeZone冷冻干燥机:美国LABCONCO公司;京制00000246电子天平:赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;D7031EASYpure II超纯水仪:巴恩斯特德国际有限公司;LABOROTA 4000旋转蒸发仪:德国海道尔夫公司;HH-SR数显恒温水浴锅:金坛市医疗仪器厂;ELX808全自动酶标仪:美国伯腾仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料制备

1.3.1.1 籽瓜瓤冻干粉、烘干粉、鲜瓤的制备

1)冻干粉

取新鲜籽瓜,清洗,去青皮和籽,籽瓜瓤打浆,纱布过滤,瓤渣、清汁分离。将清汁旋蒸浓缩(50℃~55℃,转速≥60 r/min),浓缩后的汁与瓤渣合并,混匀。放置在培养皿中冻干成粉,称重,低温避光贮存备用。

2)烘干粉

取新鲜籽瓜,清洗,将籽瓜瓤切片,于60℃烘箱中烘干,打粉称重,低温避光贮存备用。

3)鲜瓤

鲜瓜去青皮和籽的部分为鲜瓤。

1.3.1.2 籽瓜烘干粉、冻干粉、鲜瓤水提物制备

分别取冻干粉、烘干粉、鲜瓤 100 g,以 1∶20(g/mL)料液比加入蒸馏水,于60℃水浴浸提2 h,5 000 r/min离心20 min收集上清,瓤渣继续提取,反复提取3次合并上清液,上清经旋转浓缩后真空冷冻干燥,得冻干粉、烘干粉、鲜瓤水提物浸膏备用。

1.3.1.3 籽瓜瓤冻干粉醇提物制备

分别取冻干粉 100 g 各 3 份,以 1∶20(g/mL)料液比分别加入30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇,于60℃水浴浸提2 h,5 000 r/min离心20 min收集上清,瓤渣继续提取,反复提取3次合并上清液,将收集的上清旋转浓缩后真空冷冻干燥,得冻干粉30%醇提物、60%醇提物、95%醇提物浸膏备用。

1.3.2 不同提取物的酪氨酸酶抑制活性测定

酪氨酸酶活性测定方法参照Baek等的研究并稍作修改[25]。

1.3.2.1 磷酸缓冲溶液(phosphate buffered saline,PBS)

称取磷酸二氢钠7.16 g,去离子水溶解,定容至100 mL,得到溶液A。称取磷酸氢二钠3.12g,去离子水溶解定容至100 mL,得溶液B。分别精密量取A、B溶液各51 mL、49 mL,混合即得pH=6.8磷酸缓冲溶液。

1.3.2.2 酪氨酸酶溶液

所购置的酪氨酸酶规格为570 U/mg,精密称取酪氨酸酶43.86 mg,迅速转移至50 mL容量瓶中,用磷酸缓冲液溶解并定容,4℃保存。

1.3.2.3 L-酪氨酸溶液

精密称取L-酪氨酸18.10 mg至50 mL容量瓶中,用磷酸缓冲液溶解并定容。

1.3.2.4 熊果苷对照品溶液

精密称取熊果苷20.20 mg,去离子水溶解,至10 mL容量瓶中定容。

1.3.2.5 样品配制

在96孔板中配置空白组对照和样品组,用酶标仪于波长490 nm处测定吸光度分别为AB、AD,再将96孔板置于37℃培养箱孵育30 min,迅速将孵育后空白组和样品组测定490 nm处吸光度分别为AA、AC,按下式计算样品对酪氨酸酶活性的抑制率。配置空白及样品反应液组成见表1。

式中:AA为空白组孵育后的吸光度值;AB为空白组孵育前的吸光度值;AC为样品组孵育后的吸光度值;AD为样品组孵育前的吸光度值。

表1 反应液组成Table 1 Composition of reaction fluid

1.3.3 籽瓜瓤水提物定性定量分析

1.3.3.1 籽瓜瓤水提物定性分析

本试验通过双缩脲法[19]、α-萘酚法[20]、醋酐-浓硫酸法[21]、香草醛-浓盐酸法[22]、三氯化铝法[23]、碱性苦味酸反应[24]等方法,定性分析籽瓜中蛋白质、多肽和氨基酸、还原糖、多糖和甙类、皂甙类、有机酸类、酚类化合物及鞣质类、甾体及三萜类化合物、黄酮类化合物、强心甙类、蒽醌类、挥发油、油脂类、生物碱类、内酯、香豆素及其甙类等成分是否存在。

1.3.3.2 籽瓜瓤主要成分定量分析

对籽瓜瓤中的糖类、有机酸等主要成分进行定量,液相色谱法测定果糖、葡萄糖和蔗糖,以苯酚硫酸法检测粗多糖含量,维生素C含量通过液相色谱,流动相为磷酸二氢钾和十六烷基三甲基溴化铵、甲醇,流速为0.7 mL/min,检测波长245 nm。有机酸(苹果酸、柠檬酸)通过色谱法检测,流动相0.1%磷酸、甲醇,流速0.5 mL/min,210 nm下检测。参照国家相关标准如下:GB/T 10782-2006《蜜饯通则》、GB 5009.8-2016《食品安全国家标准食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》、NY/T 2016-2011《水果及其制品中果胶含量的测定分光光度法》、GB 5009.88-2014《食品安全国家标准食品中膳食纤维的测定》、SN/T 4260-2015《出口植物源食品中粗多糖的测定苯酚-硫酸法》、GB 5009.86-2016《食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定》、GB 5009.157-2016《食品安全国家标准食品有机酸的测定》。

1.3.4 籽瓜糖类、有机酸以及配比粗多糖有机酸对酪氨酸酶的抑制活性

籽瓜糖类、有机酸以及配比粗多糖有机酸对酪氨酸酶的抑制活性方法同1.3.2。

1.3.5 统计分析

GraphPrism.5.0软件统计处理数据,数据以(Mean±SD)方式表示,以单因素方差(ANOVA)进行统计学分析,试验为3次独立重复;***p<0.001为极显著性差异(与对照组比较),###p<0.001为极显著性差异(多糖有机酸混合物与冻干粉比较),具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 籽瓜瓤冻干粉不同极性提取物酪氨酸酶抑制活性

籽瓜冻干粉4种提取物对酪氨酸酶活性抑制作用见图1。

图1 籽瓜瓤不同极性提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.1 Inhibition of tyrosinase activity of seed-watermelon pulp extracted by water

由图1知,30%醇提物、60%醇提物、95%醇提物均呈浓度依赖的方式抑制酪氨酸酶活性,但其酪氨酸酶抑制活性较弱,抑制率均低于30%;其中水提物的酪氨酸酶抑制活性最强,浓度为50 mg/mL时达到50%以上,效果要优于其他3种提取物,说明其起酪氨酸酶抑制活性的成分可能是水溶性物质。

2.2 不同制备方式的籽瓜水提物酪氨酸酶抑制活性

冻干粉不同极性提取物酪氨酸酶抑制作用最好的是水提物,冻干成本高,因此考虑籽瓜瓤不同制备方式水提物的酶活抑制作用,结果见图2。

通过试验对比,由图2可发现,烘干粉水提物酪氨酸酶抑制活性最强,冻干粉水提物次之,鲜瓜瓤水提物的效果最差,因此将进一步研究加工成本较低的烘干粉水提物的抑制成分。

图2 籽瓜瓤不同制备方式水提物对酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.2 Inhibition of tyrosinase activity of seed-watermelon pulp with lyophilized and ovendry power

2.3 籽瓜瓤烘干粉水提物成分定性、定量分析

2.3.1 籽瓜烘干粉水提物成分定性分析

籽瓜瓤活性成分鉴定见表2。

表2 籽瓜瓤活性成分鉴定Table 2 Identification of seed-watermelon pulp ingredients

由定性结果可知,籽瓜瓤烘干粉中的活性成分至少有6种,其中多糖还原糖和有机酸含量较多,是其主要成分;除此之外还含有少量的酚类及鞣质、甾体及三萜、强心苷以及生物碱。由此表明籽瓜瓤成分较为丰富,水溶性物质主要为糖类、有机酸,可能是其抑制酪氨酸酶活性的主要物质。

2.3.2 籽瓜瓤中主要成分定量分析

籽瓜瓤中主要成分定量分析见表3。

表3 籽瓜瓤中糖类和有机酸定量分析Table 3 Quantitative analysis of saccharides and organic acids in seed-watermelon pulp

由定性分析可知,糖类和有机酸是籽瓜鲜瓤中的主要成分,故分别对其进行定量分析;籽瓜鲜瓤中糖类检测显示,籽瓜鲜瓤中总糖为23.577 mg/g瓜瓤,包括葡萄糖、果糖两种还原糖及多糖等糖类物质。检测籽瓜鲜瓤中有机酸表明,维生素C含有0.035 mg/g瓜瓤,苹果酸含量最高为3.465 mg/g瓜瓤,柠檬酸为0.266 mg/g瓜瓤,籽瓜鲜瓤有机酸为3.766 mg/g瓜瓤,其中以苹果酸为主。

2.4 籽瓜瓤糖类、有机酸及其混合配比对酪氨酸酶的抑制活性

2.4.1 籽瓜瓤糖类酪氨酸酶抑制活性

籽瓜瓤糖类对酪氨酸酶活性的抑制作用见图3。

图3 籽瓜瓤糖类对酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.3 Inhibition of tyrosinase activity of seed-watermelon pulp saccharides

经检测籽瓜鲜瓤中葡萄糖、果糖及粗多糖含量分别为11.0、12.0、0.577 mg/mL,以籽瓜90%含水量计,故烘干粉中的物质含量均以鲜瓤的10倍计,如图3中葡萄糖、果糖、粗多糖对酪氨酸酶抑制活性测定结果所示;籽瓜瓤粗多糖有一定的酪氨酸酶活性抑制作用,其浓度分别为0.5、1.0、1.5 mg/mL时,随浓度增高抑制活性均在5%左右,同熊果苷的酪氨酸酶抑制活性具有显著差异,说明籽瓜瓤粗多糖酪氨酸酶抑制活性不显著;从图3看出葡萄糖和果糖呈现一定的负值,表明葡萄糖、果糖具有微弱的促进酶活作用,因此籽瓜瓤糖类可能不是抑制酶活的主要成分。

2.4.2 籽瓜瓤有机酸酪氨酸酶抑制活性

根据已测籽瓜鲜瓤有机酸的含量,对酪氨酸酶抑制活性进行测定,结果见图4。

图4 籽瓜瓤有机酸对酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.4 Inhibition of tyrosinase activity of seed-watermelon pulp organic acids

图4表明籽瓜瓤中的维生素C、苹果酸、柠檬酸及其复合有机酸(含量为3.8 mg/mL)均对酪氨酸酶抑制活性较弱;以烘干籽瓜瓤中有机酸浓度为38 mg/mL,按其浓度递增,依次检测其酶活抑制作用发现,有机酸随浓度增加具有良好的酶活抑制效果,且抑制活性略高于熊果苷,同熊果苷已无显著差异;因此籽瓜成分中的有机酸可能为抑制酶活的主要活性成分。为进一步研究籽瓜瓤中糖类和有机酸与抑制酪氨酸酶活性的关系,故需对混合配比后的糖类有机酸抑制酪氨酸酶活性进行确定。

2.4.3 配比多糖有机酸酪氨酸酶抑制活性

根据籽瓜鲜瓤中多糖和有机酸的含量,以150 mg/mL浓度的烘干籽瓜粉水提物为参照,将其含量分别为1.0 mg/mL和5.7 mg/mL的多糖与有机酸进行混合配比,测定其酪氨酸酶抑制活性结果见图5。

图5 籽瓜瓤多糖和有机酸对酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.5 Inhibition of tyrosinase activity of seed-watermelon pulp saccharides and organic acids

由图5可发现多糖对酪氨酸酶抑制活性小于有机酸,两者配比混合溶液抑制酪氨酸酶的活性均好于其对应的单一溶液,说明籽瓜中的多糖和有机酸均具有一定的酪氨酸酶活抑制作用,有机酸效果好于多糖;两者配比混合溶液同烘干籽瓜粉水提物及熊果苷溶液对酪氨酸酶活性抑制率相比具有显著差异,进一步说明籽瓜除有机酸是烘干籽瓜粉中酶活抑制的主要成分外,还应存在其它酪氨酸酶活抑制成分;而150 mg/mL浓度的烘干籽瓜粉溶液同熊果苷溶液对酪氨酸酶活性抑制率类似,无显著差异。因此说明烘干籽瓜粉水提物作为酪氨酸酶抑制物与熊果苷具有类似效果,其中的有机酸和多糖仅是籽瓜抑制酪氨酸酶活性的部分成分。

3 结论与讨论

由于传统药食资源中含有的天然活性成分毒副作用小、安全性高,比化学合成的抑制剂具有更大优势,因此近年来逐渐成为酪氨酸酶抑制剂研究者的关注热点。研究表明,天然植物中的活性成分多可作为酪氨酸酶抑制剂[25-27]。《本草纲目》记载“籽瓜性味甘”、“籽瓜而入心脾胃,内有解心脾胃热,止消温”,自古以来就是一种具有较高营养和药用价值的农产品[28-29]。而且近几年有学者对籽瓜中多糖、果胶、多酚以及皂苷等化合物进行了提取及抗氧化、抗肿瘤、降血糖功效的研究[30-34],表明籽瓜瓤中多糖和多酚类物质具有一定的抗氧化活性,对属于多酚氧化酶类的酪氨酸酶来说,其催化L-酪氨酸生成黑色素为一个氧化的过程[35],因此多糖和酚类均具有潜在的抑制酪氨酸酶活作用。本文研究显示籽瓜烘干粉水提物抑制酪氨酸酶活性最强,其主要成分为糖类和有机酸,进一步定量分析后表明其中粗多糖具有酪氨酸酶活抑制作用,同已有研究结论相似,单糖对酪氨酸酶活性则具有促进作用;而籽瓜瓤中的有机酸则表现出较强的酪氨酸酶活抑制作用,其中维生素C的抑制作用与已有研究[17-18]结果一致,苹果酸和柠檬酸也有一定的酪氨酸酶活抑制作用;对籽瓜烘干粉水提物对应混合配比研究后表明,籽瓜烘干粉水提物具有与熊果苷类似的酪氨酸酶活抑制效果,但其抑制率远好于其有机酸和多糖的混合配比溶液,表明其主要的抑制酪氨酸酶活的成分除籽瓜多糖、维生素C、苹果酸和柠檬酸外,还应含有其它成分;而籽瓜中含有的少量酚类及鞣质、甾体及三萜、强心苷以及生物碱依然值得我们关注,这为深入籽瓜抑制酪氨酸酶活性成分探索提供了参考数据和方向。本研究表明籽瓜瓤作为一种潜在的酪氨酸酶活性抑制剂应用于相关产业具有巨大潜力,且本处理方法简单便捷,大规模应用后即避免了籽瓜瓤对土地污染和资源浪费,又可提升其综合利用率和经济价值。

目前,对于植物天然活性成分中筛选酪氨酸酶抑制剂的研究逐渐增多,其中黄酮和酚类物质为多[15,35],有机酸中的维生素C更是一种公认的酪氨酸酶抑制剂[36],且本研究也揭示了籽瓜中有机酸具有较好的酪氨酸酶抑制作用;但现有大部分研究只停留在某一类物质的体外酪氨酸酶抑制活性探究,并未分离纯化其确切是何种物质,或进行深入的作用机理研究。所以,对烘干籽瓜粉的酪氨酸酶抑制作用还需要进一步研究其所有成分并深入探讨抑制机制,才可能对籽瓜大规模的深加工提供全面的理论支撑。

猜你喜欢
瓜瓤冻干粉提物
岭南山竹子醇提物对溃疡性结肠炎小鼠的作用
丝瓜瓤:老一辈的“清洁神器”
N-烷基化壳聚糖/白芨多糖复合材料制备
冻干粉护肤,效果真的很好吗
糖尿病杂感
飞龙掌血醇提物的抗炎镇痛作用
阿纳其根醇提物对冈田酸诱导PC12细胞损伤的保护作用
葫芦钻水提物的抗炎镇痛作用及其急性毒性
《猪瘟高免血清冻干粉的初步研究》图版
基于机器视觉技术的西瓜瓜瓤的识别方法