阳荷不同极性部位体外抑菌活性研究

蔡依，郭百臻，徐津林，李肖，段金辉，阮金兰，*

（1.武昌理工学院生命科学学院，湖北武汉430223；2.武汉工程大学环境生态与生物工程学院，湖北武汉430073）

阳荷（Zingiber striolatum Diels）系姜科姜属多年生草本植物，药用其新鲜根茎的嫩芽，广泛分布四川、贵州、广西、湖北、湖南、江西、广东等地；生于林荫下、溪边，海拔300 m～1 900 m。阳荷是野生蔬菜，一年种植多年生长，能经受恶劣的环境磨炼，生命力极强，基本上无病虫害，无须使用农药，且多地均有栽培。阳荷是食药同源，嫩芽、茎果味道香甜，可直接烹饪食用，富含有丰富的膳食纤维、必需氨基酸、蛋白质，具有抗菌、抗氧化、活血、化瘀、降血糖、治疗痛经等作用，药用价值非常高[1]。资源丰富的天然药物是活性化合物的天然宝库，植物的抗菌能力是它们在物种繁杂的自然界中长期与各类细菌斗争的结果，植物提取物中的黄酮、香豆素、多糖等均具有明显的抗菌活性[2]。现阶段，国内外对阳荷的研究主要集中在膳食纤维、红色素、多糖和降血糖等方面[3-6]，阳荷粗提物及不同极性萃取物鲜有报道，本课题采用体外抑菌活性测定的方法，对我国民间药食两用的植物阳荷进行了体外抑菌活性研究，为阳荷的体外抑菌活性提供理论研究，进而为合理有效的利用天然药用植物提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料

阳荷：湖北省利川市现代农业公司，经本课题组华中科技大学同济药学院阮金兰教授鉴定为姜科姜属植物阳荷（Z.striolatum Diels）的幼嫩芽苞。

1.2 菌株

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）：武昌理工学院生命科学学院细胞室提供。

1.3 试剂与仪器

牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、氢氧化钠、琼脂、无水乙醇、石油醚（沸点60℃～90℃）、乙酸乙酯、正丁醇、二甲基亚砜：国药集团化学试剂有限公司；碘硝基四唑紫：上海麦克林生化科技有限公司；链霉素：北京中农济兴生物技术有限公司；滤纸片：通用电气生物科技有限公司；精密pH试纸：上海三爱思试剂有限公司。

BMX-30R高压灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；OHG-9073BS-Ⅲ生化培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；SY-500旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；ME104E/02超净工作台：上海尚道仪器制造有限公司；0.5麦氏比浊管：上海广锐生物科技有限公司；SPX-150BSH-Ⅱ电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；HH-S2恒温鼓风干燥箱：上海新苗医疗器械制造有限公司。

1.4 阳荷乙醇提取物及不同极性萃取物的制备

将新鲜阳荷洗净于60℃恒温鼓风干燥箱中烘干，打粉，过40目筛，70%乙醇回流提取阳荷粉末，旋转蒸发仪减压回收乙醇至无醇味，得乙醇提取物，乙醇提取物与水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，旋转蒸发仪减压回收有机溶剂，得到阳荷乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物，经真空干燥后密封保存于4℃[7]。

1.5 培养基的制备

量取1 L纯化水于烧杯中，依次加入牛肉膏3.0 g、氯化钠5.0 g、琼脂15 g、蛋白胨10 g，加热溶解，用精密pH试纸测定pH值，用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至7.2，分装于锥形瓶中，103.43 kPa和121℃高压灭菌20 min，4℃冷藏备用[8]。

1.6 菌种的活化

将固体培养基平铺于培养皿，用划线法将菌种接种于培养皿中，37℃恒温培养24 h，观察菌种生长状态，所有操作均在无菌条件下操作。

1.7 菌悬液的制备

将已接种的单一菌落与液体培养基混合均匀，制备成菌悬液，将菌悬液与麦氏比浊管比较，使菌悬液的密度为1.5×108CFU/mL[9]，于4℃冷藏保存，备用，所有操作均在无菌条件下操作。

1.8 抗菌初筛样品的制备

分别精密称取阳荷乙醇提取物及各萃取物1.0 g和 0.5 g，用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解样品，配制成高低浓度分别为0.1 g/mL和0.05 g/mL的供试样品。

1.9 抑菌活性初筛（滤纸片法）

将直径为6 mm的滤纸片分别浸泡于样品溶液、空白对照溶液（DMSO溶液）和阳性对照溶液（链霉素溶液）中，取 200 μL 密度为 1.5×108CFU/mL 的菌悬液均匀涂布在固体培养基上，室温放置至无明显液体流动，将滤纸片贴片在固体培养基上，37℃恒温培养24 h后测定抑菌圈，每个样品重复测定4次，所有操作均在无菌条件下操作[10]。

1.10 最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）样品的制备

初筛后具有抑菌活性的供试样品用二倍稀释法稀释成不同浓度，依次为 25、12.5、6.25、3.125 mg/mL，4℃冷藏备用。

1.11 最低抑菌浓度（MIC）的测定

在96孔板中，第一列至第十列为供试样品孔，第十一列为空白对照孔，第十二列为阳性对照孔，样品孔每孔加入100 μL液体培养基，50 μL初筛后的样品，加入50 μL菌液，用摇床在37℃摇匀，用含10%DMSO的液体培养基做空白对照和0.1 g/L的链霉素溶液做阳性对照，每个浓度均设3个复孔做平行对照，在37℃恒温培养箱中培养24 h，加入40 μL 0.2 g/L的碘硝基四唑紫，以微孔中是否出现紫色来检查有无细菌生长，以不出现紫色的微孔浓度为最低抑菌浓度[11]，所有操作均在无菌条件下操作。

1.12 最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）的测定

将未出现紫色的微孔浓度样品取出200 μL，均匀涂步在固体培养基上，37℃恒温培养24 h，未出现菌落的即为MBC值，所有操作均在无菌条件下操作[12]。

2 结果与分析

2.1 乙醇提取物及各极性萃取物的抗菌作用

本试验选用了4种革兰氏阴性菌（肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌）和4种革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌），对阳荷的乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物进行体外抑菌活性试验，抗菌结果见表1。

表1 阳荷乙醇提取物及各萃取物的抑菌圈直径（±s，n=4）Table 1 The dismeter of inhibition zone of extract and ethanol extract of Z.striolatum Diels（±s，n=4）

表1 阳荷乙醇提取物及各萃取物的抑菌圈直径（±s，n=4）Table 1 The dismeter of inhibition zone of extract and ethanol extract of Z.striolatum Diels（±s，n=4）

注：-表示未检出。

阳荷乙醇提取物及各萃取物对苏云金杆菌均无抑菌活性；乙醇提取物对鲍曼不动杆菌抑菌效果显著；石油醚萃取物相比较于其他相，对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌抑菌活性较强，能显著抑制细菌的生长繁殖，与乙醇提取物的抑菌活性相当；乙酸乙酯萃取物对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌效果较强，对鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和粪肠球菌有抑菌圈，但是无MBC值；正丁醇萃取物对鲍曼不动杆菌抑菌效果较强，仅次于石油醚萃取物，对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有抑制效果，对其他菌均无MBC值；水萃取物对金黄色葡萄球菌抑菌圈数值最大，但是没有MBC值，对肺炎克雷伯菌、枯草芽孢杆菌和粪肠球菌有较好的抑菌效果，对鲍曼不动杆菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌没有MBC值；空白对照无抑菌圈。

2.2 MIC值的测定

阳荷乙醇提取物及各萃取物对7种菌的最低抑菌浓度见表2。

表2 阳荷乙醇提取物及各萃取物的最低抑菌浓度Table 2 The minimum inhibitory concentration of extract and ethanol extract of Z.striolatum Diels

5个供试样品均对肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌有显著的抑制作用，其中石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌抑菌效果十分显著，MIC值达到了3.125 mg/mL。

2.3 MBC值的测定

阳荷乙醇提取物及各萃取物对7种菌的最低杀菌浓度见表3。

表3 阳荷乙醇提取物及各萃取物的最低杀菌浓度Table 3 The minimum bactericidal concentration of extract and ethanol extract of Z.striolatum Diels

阳荷乙醇提取物及各萃取物对肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的最低杀菌浓度均为25 mg/mL，乙醇提取物和石油醚萃取物杀菌效果较其他相优。

3 结论

本试验对阳荷乙醇提取物及不同极性萃取物进行体外抑菌活性研究，试验结果表明乙醇提取物和石油醚萃取物相比较于乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物对肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、粪球肠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和鲍曼不动杆菌生长抑制作用更明显，石油醚萃取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和粪肠球菌的抑菌效果优于乙醇提取物，由此可见，抑菌活性部位主要为乙醇提取物和石油醚萃取物，即脂溶性成分作用明显，且经过萃取的石油醚萃取物作用较乙醇提取物作用更显著[13]。阳荷乙醇提取物及不同极性萃取物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制作用，显示出广谱抑菌活性。后续试验可以将阳荷脂溶性部位分离、纯化，研究阳荷抑菌有效成分、作用机制，将阳荷的有效抑菌成分与市面上现有的食品防腐剂比较保鲜性能。为具有抑菌功能的天然、无毒的食品添加剂或者食品防腐剂提供理论试验依据。