HPLC法测定小麦粉中的间苯二酚

阳文武朱泽兵周 浓万 莉*

1（重庆市万州食品药品检验所，重庆404000）

2（重庆三峡学院生命科学与工程学院，重庆404000）

间苯二酚，也称雷琐酚、雷琐辛，是苯间位两个氢被羟基取代后形成的化合物，具有杀菌作用，可用作防腐剂，主要用于橡胶粘合剂、合成树脂、染料、分析试剂等方面。间苯二酚具有中等毒性，能刺激皮肤、黏膜，同时可经皮肤迅速吸收，生成高铁血红蛋白而引起发绀、昏睡和致命的肾脏损伤。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单中，间苯二酚属于3类致癌物之一。因间苯二酚有防腐，抗褐变的作用，被用于小麦粉粉或面条粉改良剂中。为规范生产行为，加强小麦粉质量安全监管，2017年底，食药监局发布《进一步加强小麦粉质量安全监管的公告》。《公告》要求，严禁生产企业在小麦粉中添加过氧化苯甲酰、次磷酸钠、硫脲、间苯二酚、过硫酸盐、噻二唑、曲酸等非食品原料。国内外已有报道的间苯二酚检测方法主要有滴定法、紫外分光光度法、高效液相色谱方法，滴定法主要用于间苯二酚原料药的测定；紫外分光光度法准确度低、灵敏度低；高效液相色谱法主要用于化妆品、药品中间苯二酚的测定。本文采用高效液相色谱法检测小麦粉中的间苯二酚，操作简便，准确度、精密度好，灵敏度高，完全能够满足于检验机构日常检测任务的要求。

1 仪器与试剂

Agilent1260型高效液相色谱仪，KH-2000DB超声清洗机，Sartorius万分之一电子分析天平（QUINTIX224-1CN），间苯二酚对照品（购买于中国食品药品检定研究院，编号为BZJ001-1502、质量分数为99.0%），甲醇、甲酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 标准溶液配制

2.1.1间苯二酚标准储备液

精密称取间苯二酚标准品0.098 98 g（质量分数为99.0%） 于100 mL容量瓶中，用体积浓度20%甲醇溶液溶解并定容至刻度，得质量浓度为979.9μg/mL的标准储备液，贮存于4℃冰箱中，避光保存。

2.1.2 间苯二酚标准中间液

吸取标准储备液1.0mL于100mL容量瓶中，用体积浓度20%甲醇溶液定容至刻度，得质量浓度为9.799μg/mL的标准中间液，贮存于4℃冰箱中，避光保存。

2.1.3 间苯二酚标准系列工作液

分别准确吸取不同体积的标准中间液，用体积浓度20%甲醇溶液将其稀释成间苯二酚含量分别 为 0.245 μg/mL、 0.490 μg/mL、 2.450 μg/mL、4.900μg/mL、9.799μg/mL的标准系列工作液。临用时配制。

2.2 供试品溶液的制备

准确称取混合均匀的试样1 g（精确到0.001 g）于50mL具塞比色管中，加入体积浓度20%甲醇溶液35mL，涡旋分散均匀，超声处理（功率300W，频率40 kHz） 20 min，冷却至室温后，用体积浓度20%甲醇溶液定容至50 mL刻度线，混匀，静置5 min，取适量上清液过0.22μm滤膜，待液相色谱测定。

2.3 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：DiamonsilC18（4.6mm×250mm，5μm），流动相：甲醇－体积浓度0.1%甲酸溶液（体积比20∶80），流速 1.0mL/min，检测波长274 nm，柱温35℃，进样量：20μL。在上述色谱条件下，间苯二酚的保留时间为8.921min，且色谱峰分离度良好，色谱图见下页图1、图2、图3。

2.4 检出限

按GB/T16631-2008《高效液相色谱法通则》以3倍信噪比计算最低检测限为10mg/kg。

2.5 精密度试验

精密吸取对照品溶液20μL，按“2.3”项下色谱条件连续进样6次，测定成分峰面积。结果间苯二酚峰面积的RSD为0.66%。

2.6 加样回收率试验

精密称取已知含量（未检出间苯二酚）的小麦粉9份，每份约1 g，以3份为一组，每组分别精密加入标准中间溶液1.0mL、3.0mL、10mL，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率。结果见表1。

表1 小麦粉中间苯二酚加样回收率结果

每组的平均回收率分别为96.4%、99.2%、99.1%，RSD分别为0.25%、0.18%、0.10%，表明该方法准确度良好。

2.7 稳定性试验

取同一加标试样溶液分别在0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h进样测定。结果间苯二酚峰面积的RSD为0.72%，说明加标试样溶液在20 h内稳定。

图1 对照品色谱图

图2 样品色谱图

图3 加标回收色谱图

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法的选择

在供试品溶液制备中，比较了提取溶剂（水、体积浓度20%甲醇、体积浓度50%甲醇），超声提取时间（10min、20min、30min），提取溶剂用量 （25mL、35 mL、50 mL） 对测定结果的影响，最终确定了“2.2”项中的方法。

3.2 色谱条件的选择

系统适用性试验中，比较了甲醇-水、甲醇-0.02mol/L乙酸铵水溶液、甲醇-体积浓度0.1%甲酸水溶液3种流动相，同时比较了不同流速（0.8 mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min） 对测定结果的影响，最终确定了“2.3”项的色谱条件。间苯二酚的最大吸收波长在274 nm附近，故选择274 nm作为检测波长。