姜黄素对CCl4所致急性肝损伤大鼠的保护作用及其机制研究*

隋菱，杜纪坤，郑静彬，蔡国弟，李莉

姜黄素（curcumin）是姜科草本植物姜黄（curcuma longa）根茎的主要活性成分，是一种具有β-二酮结构的多酚类化合物，广泛应用于制作调味剂、食品色素和中草药。近年来，姜黄素成为天然药物中的研究热点，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤[1-4]等广泛的药理作用。肝脏是人体的重要器官，是物质合成与代谢、能量产生和转换的重要枢纽，因此肝脏极易受到各种外源性物质的损伤，从而引起急性或慢性肝脏疾病[5，6]。已有研究表明，姜黄素对肝损伤具有很好的治疗作用[7，8]。本研究在四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）诱导的急性肝损伤大鼠，观察了姜黄素的干预效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与药物 健康雄性SPF级SD大鼠60只，购自南方医科大学实验动物中心，CCl4和姜黄素（Sigma公司）；检测乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒（Thermo Fisher Scientific公司）；检测白介素 -6（interleukin-6，IL-6）和瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的ELISA试剂盒（Bio-Rad公司）；检测环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2） 的 ELISA 试剂盒（Cell Signaling Technology公司）；检测前列腺素 E2（prostaglandin 2，PGE2）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 急性肝损伤模型的制备 随机将大鼠分为对照组、模型组、小剂量姜黄素组、中剂量姜黄素组、大剂量姜黄素组和水飞蓟素组，每组10只。姜黄素给药组分别按 25 mg·kg-1、50 mg·kg-1、100 mg·kg-1姜黄素灌胃，水飞蓟素组按100 mg·kg-1灌胃，在对照组、模型组则给予等体积生理盐水灌胃，共30 d。在末次给药1 h后，给予模型组和姜黄素组CCl4（20 mg·kg-1）玉米油溶液（2 ml·kg-1）腹腔注射，给予对照组腹腔注射等体积玉米油溶液，禁食不禁水。24 h后，给予动物乌拉坦麻醉，经下腔静脉取血，离心后取得血清，置于-20℃保存。采血后迅速摘除肝脏，用冷PBS缓冲液洗涤干净，滤纸吸干水分后，置于-80℃保存。

1.3 肝组织病理学检查 取肝组织，置于10%福尔马林固定，常规脱水浸蜡，石蜡包埋，5 μm连续切片，脱蜡透明后行HE染色，光镜下观察各组大鼠肝组织病理学变化。

1.4 血清LDH和PGE2水平检测 按照试剂盒操作说明书操作测定。

1.5 肝组织匀浆 IL-6、TNF-α 和 COX-2水平检测 取肝组织，加入9倍量生理盐水后用超声粉碎机粉碎，制成组织匀浆，取上清。使用Luminex 100 analyzer（Luminex Corp.Austin，TX），按照 Bio-Rad公司试剂盒说明书检测IL-6和TNF-α水平。采用MasterPlex QT Analysis version 2（MiraiBio，Alameda，CA）制作标准曲线，进行定量分析。按照试剂盒说明书操作测定COX-2水平。

2 结果

2.1 姜黄素对CCl4所致急性肝损伤大鼠肝组织病理学变化的影响 对照组大鼠肝小叶结构完整、清晰，肝细胞呈索状排列，无坏死及脂肪变性（图1A）；与对照组比，CCl4模型组可见以中央静脉区为中心的大片状肝细胞坏死、肿胀、空泡形成和炎性细胞浸润，大部分正常肝小叶结构被破坏或消失，肝细胞索状排列紊乱，肝组织损伤明显（图1B）；水飞蓟素组肝细胞浊肿减轻，炎性细胞浸润减少（图1C）；经大、中、小剂量姜黄素处理后，肝小叶中心大片状肝细胞坏死、肿胀、空泡形成和炎性细胞浸润均有不同程度的减少，肝组织损伤均有不同程度的改善（图1D～F），其中大剂量姜黄素组和水飞蓟素组效果最好，组织学改变趋于正常。

图1 各组大鼠肝组织病理学变化（HE，100×）

2.2 各组大鼠血清LDH和PGE2水平变化 模型组大鼠血清LDH 水平为（6458.00±423.72）IU/L，显著高于对照组[（1375.00±67.45） IU/L，P<0.001]，而提前给予大剂量姜黄素处理组和水飞蓟素处理组的大鼠血清LDH 水平均显著降低（P<0.05），提示姜黄素对CCl4所致的急性肝损伤具有保护作用；模型组大鼠血清 PGE2 含量为（130.02±4.30）pg/ml，明显高于对照组[（51.27±0.86）pg/ml，P<0.001]，而在各剂量姜黄素和水飞蓟素干预组大鼠血清PGE2水平均显著低于模型组（P<0.05）。

2.3 各组大鼠肝组织匀浆细胞因子水平比较 模型组肝组织IL-6和TNF-α含量显著高于对照组（P<0.01），表明CCl4能够有效刺激肝细胞分泌炎性细胞因子IL-6和TNF-α。各剂量姜黄素处理组和水飞蓟素组可以显著降低大鼠肝组织匀浆细胞因子水平（P<0.01，表1），提示姜黄素对CCl4诱导的炎性细胞因子分泌具有抑制作用，其作用呈剂量依赖性增强。

表1 各组大鼠肝组织匀浆细胞因子水平（±s）比较

表1 各组大鼠肝组织匀浆细胞因子水平（±s）比较

与对照组比，①P<0.01；与模型组比，②P<0.01

IL-6（μM） TNF-α（μM）对照组 10 52.8±3.0② 67.4±5.2②模型组 10 102.5±6.3① 120.3±3.5①小剂量姜黄素 10 83.7±3.3② 109.3±5.8②中剂量姜黄素 10 71.3±2.4② 87.2±3.7②大剂量姜黄素 10 61.0±3.0② 71.3±6.2②水飞蓟素 10 59.8±3.6② 70.4±2.2②只

2.4 各组大鼠肝组织匀浆COX-2水平比较 COX-2是一种诱导酶。当肝脏出现炎症后，肝组织COX-2水平增加[9]。本研究发现模型组大鼠肝组织COX-2含量为（423.74±12.42）pg/mg/ml，显著高于对照组的［（232.45±13.95）pg/mg/ml，P<0.01]，而大、中、小剂量姜黄素组和水飞蓟素组大鼠肝组织COX-2含量均较模型组显著降低（P<0.01，图2）。

图2 各组大鼠肝组织匀浆COX-2水平比较

3 讨论

CC14是经典的诱导实验性肝损伤动物模型的外源性化合物，被广泛用于护肝药物的筛选和研发[10-12]。CCl4致肝损害的主要机制为肝内活化后产生强毒性的二氯甲基自由基（·CCl2）和过氧化甲基自由基（·OOCC12），引发脂质过氧化，导致肝细胞膜的通透性增加，肝细胞内大量储存的LDH被释放进入血循环。本实验发现，经CCl4处理后的大鼠血清LDH水平与对照组相比显著升高。在各剂量姜黄素和水飞蓟素预处理之后，各组大鼠血清LDH明显低于CCl4模型组，表明姜黄素具有一定的膜稳定作用，减轻了肝损伤程度，对CCl4诱导损伤的肝细胞起到了较好的保护作用。

各种因素造成肝损伤时，肝组织Kuffer细胞被激活，产生并释放大量的细胞因子，如IL-6和TNF-α等，参与肝脏的炎性损伤[13-15]。本实验结果显示，与对照组比，模型组大鼠肝组织IL-6和TNF-α含量明显增高，而不同剂量姜黄素给药组和水飞蓟素组可以显著降低CCl4致肝损伤大鼠肝组织IL-6和TNF-α水平，表明姜黄素可抑制肝脏损伤后IL-6和TNF-α的异常活化，减少炎症的发生，通过抑制肝脏炎症因子的产生，保护肝脏。

COX-2是一种诱导型酶。在正常状态下在大多数组织中很少表达COX-2，但当细胞受到致病因素等刺激时，Kuffer细胞被激活，产生大量细胞因子，可诱导COX-2合成和释放，参与肝脏炎性损伤。大量报道证实，COX-2抑制剂可以缓解CCl4所致的肝损伤[9，16-19]，这也为肝损伤的治疗提供了新的思路。花生四烯酸通过COX-2生成代谢产物前列腺素（prostaglanding，PGs），是炎症反应的重要介质，该途径被认为是急慢性炎症的重要通路。炎症的发生发展与PGs含量关系密切，而在炎症过程中，PGE2作用最强。研究表明，COX-2及其产物PGs通过介导蛋白质、糖类及脂肪代谢，干扰肝脏正常的代谢功能，参与肝脏的炎性损伤[21-25]。本实验结果显示，模型组大鼠肝组织COX-2含量增多，且血清PGE2含量异常增高，推测其通过激活环氧合酶途径介导肝细胞损伤。与模型组相比，姜黄素给药组COX-2含量显著降低，并且PGE2水平显著降低，可能是由于姜黄素抑制了由CCl4引起的一系列免疫应答所产生的炎性因子，从而使COX-2含量减少，逆转炎症因子对肝细胞所造成的损伤，从而改善肝功能。

综上所述，姜黄素对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤有保护作用，可能是通过抑制大鼠肝组织CCl4的代谢，抑制炎症反应的激活，减少细胞因子的释放而实现的。但是，姜黄素对肝脏作用的具体机理和对人体的作用如何，还有待于进一步的研究。