FOXK1对肝癌高转移细胞系Huh7侵袭和迁移能力的影响

倪路 赵志强 高越 母汉正 齐云飞

作者单位：836500 新疆阿勒泰 中国人民解放军第十六医院消化内科

肝癌是常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率均位列我国恶性肿瘤前五［1-2］，癌细胞异常增殖和转移是影响其预后的主要因素［3-4］。叉头框转录因子1（FOXK1）是FOX 转录因子家族成员之一［5］，在结肠癌［6］、前列腺癌［7］、食管癌［8］、胃癌［9］、卵巢癌［10］等多种肿瘤中高表达，且与肿瘤临床病理分期和转移关系密切。本研究前期通过GENT数据库（http：//medical-genome.kribb.re.kr/GENT/或http：//genome.kobic.re.kr/GENT/）分析 FOXK1在肝癌组织中的表达，发现FOXK1在肝癌和癌旁正常组织中的表达量差距较大，推测其可能在肝癌转移过程中发挥重要作用。本研究拟通过改变FOXK1在细胞内的表达水平，观察FOXK1改变对肝癌高转移细胞Huh7侵袭和迁移能力的影响，为进一步阐明肝癌转移机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

收集2015年1月至2017年1月中国人民解放军第十六医院40例肝癌患者癌组织及其对应癌旁正常组织（距癌组织3～5 cm）标本，其中女性15例，男性25例；平均年龄50岁；病理分型均为肝细胞癌。标本由本实验室组织库-80℃液氮保存，采集前均经本院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。肝癌高转移细胞Huh7、肝癌细胞BEL7402和正常肝细胞HL7702为中国人民解放军空军军医大学消化病医院实验室保存。胎牛血清、RPMI 1640培养液、0.25%胰蛋白酶购自Gibco公司，Transwell小室购自Millipore公司，Matrigel生物胶购自美国BD公司，Total RNA KitⅠ（50）R6834-01购自OMEGA Bio-Tek公司，FOXK1引物、反转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq TMⅡ购自Takara公司，Lipofectamine 2000 Reagent购自Invitrogen公司，4%多聚甲醛购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，结晶紫购自西安国安生物科技有限公司。

1.2 细胞培养和转染

肝癌高转移细胞Huh7、肝癌细胞BEL7402和正常肝细胞HL7702用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液于37℃、5%CO2培养箱中培养。0.25%胰蛋白酶消化对数生长中期细胞，将细胞接种于6孔板中，5×105个/孔，待细胞贴壁后转染。按Lipofectamine 2000 Reagent转染试剂盒说明书实验步骤操作，将50 pmol FOXK1小干扰RNA（FOXK1 siRNA，Huh7-si FOXK1转染组）和50 pmol FOXK1阴性对照（Huh7-NC组）转染 Huh7细胞，4～6 h后更换培养液，48 h后提取RNA，实时定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测转染后FOXK1 mRNA的表达，收集细胞进行后续功能实验。

1.3 qRT-PCR检测FOXK1 mRNA的表达

采用Total RNA Kit分别提取肝癌组织及癌旁正常组织、正常肝细胞HL7702、肝癌细胞BEL7402和肝癌高转移细胞Huh7总RNA进行前期验证，提取转染FOXK1 siRNA及阴性对照的Huh7细胞总RNA，紫外分光光度计RNA定量，反转录试剂盒将提取的总RNA反转录成cDNA。qRT-PCR检测FOXK1 mRAN的表达，以GAPDH为内参，按照试剂盒操作说明书进行。引物序列：FOXK1上游引物为5'-GCCTCCTTGACAATACCGCT-3'，下游引物为5'-TTCCAAACCCTCCCTCTGGT-3'，扩增片段 375 bp；GAPDH 上游引物为5'-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3'，下游引物为5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'，扩增片段 168 bp。qRT-PCR 反应条件：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。根据各基因2-△△Ct值计算相对表达量，实验重复3次。

1.4 Western blot检测FOXK1蛋白的表达

收集细胞，提取肝癌组织及癌旁正常组织、正常肝细胞HL7702、肝癌细胞BEL7402和肝癌高转移细胞Huh7总蛋白进行前期验证，提取转染FOXK1 siRNA及阴性对照的Huh7细胞，BCA法测定蛋白浓度。加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100℃加热变性处理。每个泳道上样15 μg总蛋白，20 mA恒流电泳约60 min，终止电泳。采用湿转法将蛋白转至NC膜，5%脱脂牛奶室温封闭 3 h，加入FOXK1 一抗（1∶1000）4℃冰箱过夜，二抗（1∶1 000）室温孵育 1 h，ECL 显影、保存图像，以β-actin为内参。采用Image J软件分析结果，将Western blot图片转换成灰度图片，分析灰度值。

1.5 Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力

取Transwell小室放入24孔板内，Matrigel 1∶8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，室温风干；Huh7-si FOXK1转染组和Huh7-NC组细胞常规消化，RPMI1640培养基重悬，调整细胞密度至1×105个/mL，取细胞悬液200 μL加入已铺Matrigel胶的Transwell上层小室，将600 μL含20%胎牛血清的RPMI 1640培养基加入下层小室；常规培养48 h，取出Transwell小室，擦去上室内面细胞，4%多聚甲醛固定15 min，0.5%结晶紫溶液染色15 min，显微镜下观察，随机取5个视野，计数细胞数量。细胞迁移实验不需提前铺Matrigel基质胶，其他步骤同细胞侵袭能力检测方法。

1.6 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，数据用均数±标准差（±s）表示，肝癌组织及癌旁正常组织中FOXK1 mRNA表达的比较采用配对t检验；多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），若组间差异有统计学意义，进一步的两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌组织及不同肝细胞中FOXK1 mRNA和蛋白的表达

qRT-PCR检测结果显示，FOXK1 mRNA在肝癌组织中的表达高于癌旁正常组织（2.87±0.21 vs 1.35±0.11，P=0.004），见图1；FOXK1mRNA在正常肝细胞HL7702、肝癌细胞BEL7402和肝癌高转移细胞Huh7中的相对表达量分别为 1.00±0.09、1.32±0.19、1.75±0.32，FOXK1蛋白的表达量分别为1.00±0.15、3.50±0.45、2.10±0.33。与正常肝细胞HL7702比较，肝癌高转移细胞Huh7及肝癌细胞BEL7402中FOXK1 mRNA及蛋白的表达显著升高（P＜0.001），见图 2。

图1 肝癌组织及癌旁正常组织中FOXK1 mRNA的表达

图2 不同肝细胞中FOXK1蛋白和mRNA的表达

2.2 下调FOXK1表达可抑制肝癌高转移细胞Huh7 FOXK1mRNA和蛋白的表达

转染FOXK1 siRNA 48 h后提取mRNA，72 h后提取蛋白。qRT-PCR和Western blot检测结果显示，Huh7-si FOXK1转染组FOXK1 mRNA相对表达量明显低于 Huh7-NC 组 （0.35±0.07 vs 1.00±0.14，P=0.002），Huh7-si FOXK1转染组和Huh7-NC组FOXK1蛋白表达量分别为0.21±0.06和1.00±0.15，差异有统计学意义（P=0.003），见图 3。

图3 转染后不同处理组Huh7细胞FOXK1蛋白和mRNA的表达

2.3 下调FOXK1表达可降低肝癌高转移细胞Huh7的侵袭能力

Transwell侵袭实验结果显示，Huh7-si FOXK1转染组穿膜细胞数为（96±17）个，Huh7-NC组穿膜细胞数为（198±35）个，Huh7-si FOXK1组穿膜细胞数明显低于Huh7-NC组（P=0.009），见图4。

图4 不同处理组Huh7细胞的侵袭细胞数目（苏木紫染色法，×200）

2.4 下调FOXK1表达可降低肝癌高转移细胞Huh7的迁移能力

Transwell迁移实验结果显示，Huh7-si FOXK1转染组穿膜细胞数为（102±19）个，Huh7-NC组穿膜细胞数为（205±21）个，Huh7-si FOXK1组穿膜细胞数明显低于 Huh7-NC 组（P＜0.001），见图 5。

图5 不同处理组Huh7细胞的迁移细胞数目（苏木紫染色法，×200）

3 讨论

肝癌已成为世界上发病率及死亡率仅次于胃癌的第二大消化系恶性肿瘤，但其发病及发展机制尚未阐明，预后有待改善［11］。研究发现，针对肿瘤细胞增殖、转移等相关分子的靶向治疗在肝癌诊断及治疗中具有重要作用，发现新的靶分子或可改善肝癌疗效及预后。FOXK1是FOX转录因子家族成员之一，具有重要的转录调控作用。Zhang等［9］研究发现miR-646可通过靶向FOXK1调节胃癌细胞增殖及侵袭；FOXK1通过与FHL2相互作用亦可促进结肠癌细胞侵袭和转移［12］。而 Li等［10］在卵巢癌中亦发现FOXK1 可通过P21调节其细胞增殖。本团队前期通过GENT数据库检索，亦发现与正常组织相比，头颈部恶性肿瘤、肾癌、肝癌、肺癌、皮肤癌和胰腺癌等多种恶性肿瘤组织中FOXK1表达更高，以上研究结果提示FOXK1在肿瘤形成、发展及细胞增殖中可能发挥重要作用，或可作为肿瘤治疗的潜在靶点。但目前FOXK1在肝癌中的表达及其作用，相关研究较少，FOXK1高表达是否与肝癌发展有关尚未明确。本研究在40例肝癌组织与癌旁正常组织内验证了FOXK1的表达，发现FOXK1在肝癌组织中的表达高于癌旁正常组织，与数据库检索结果一致；qRT-PCR和Western blot检测发现肝癌高转移细胞Huh7和肝癌细胞BEL7402中FOXK1的表达明显高于正常肝细胞HL7702，亦与数据库分析结果一致，提示FOXK1可能参与肝癌的发生发展。

肝癌细胞转移是导致患者治疗及预后不佳的重要原因，抑制肝癌细胞转移是抑制肝癌发展、改善患者预后的重要手段。为进一步研究FOXK1在肝癌侵袭和转移中的作用，本研究在肝癌高转移细胞Huh7中转染FOXK1小干扰RNA，发现转染后可下调肝癌高转移细胞Huh7 FOXK1 mRNA和蛋白的表达，说明本研究成功构建了对FOXK1具有干扰作用的siRNA。进一步行Transwell侵袭和迁移实验检测，发现转染FOXK1-siRNA后，肝癌高转移细胞Huh7侵袭细胞和迁移细胞的数目显著减少，提示FOXK1可能参与了肝癌转移和侵袭，下调其表达可引起肝癌高转移细胞Huh7转移及侵袭能力下降，有望成为肝癌的治疗靶点，但FOXK1通过何种途径发挥作用，其具体机制尚需进一步研究。