苦参不同炮制品生物总碱含量测定及HPLC指纹图谱研究

常楚瑞 陆平祝 龙庆德 冉启军 王晓丽 许德勇

【摘 要】 目的：对苦参不同炮制品的生物总碱含量进行测定，并建立苦参生物碱HPLC指纹图谱。方法：采用紫外分光光度法进行苦参生物碱含量测定，采用高效液相色谱法，以Inertsil NH2（5 μm，4.6 mm×250 mm）为色谱柱，乙腈-无水乙醇-3%磷酸（84∶10∶6）为流动相，流速为1.0mL/mim，检测波长为210 nm，柱温为30 ℃。并利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版软件进行图谱对比。结果：麸制品生物总碱含量最高，为3.955%；炒炭品生物总碱含量最低，为2.604%；各炮制品共有峰的相对保留时间RSD<1.50%，峰面积RSD>26.0%，苦参炮制品指纹图谱相似度在0.231%～0.962%。结论：苦参中主要生物碱成分差异不大，但其量有变化，炮制品的品质不一致，此方法较全面地反映苦参不同炮制品的差异，可用于评价苦参炮制品的质量。

【關键词】 苦参；苦参生物碱；炮制；指纹图谱；质量控制

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2018）04-0014-04

Abstract：Objective Determination of different biologicalcontent of Matrine alkaloids， and establish the HPLC fingerprint of alkaloids in Sophora flavescens Ait.Methods Determination of alkaloids content by UV spectrophotometry，use the method of HPLC，a Inertsil NH2 （5μm， 4.6 ×250mm） phase column was used with mobile phase consisited of acetonitrle-anhydrod alcohol- 3% acid solution phosphorie （84∶10∶6） at a flow rate ofthe mL/min. the wavelength of detector was hanol： 3% phosphoric acid as mobile phase， the flow rate is 1.0mL/mim， the detection wavelength is 210nm，the column temperature is nm.the column at 30℃.The experimental data were analyzed by computer aided similarity evaluation software.Results Bran products total alkaloids content was the highest for 3.955%， content of total alkaloids was the lowest which was 2.604%.There are various processed products peak relative retention time RSD<1.50%，and relative retention peak area RSD>26.0%，Sophora processed products fingerprint similarity in 0.231%～0.962%. Conclusion The main alkaloids in Sophora little difference，but its content has changed and inconsistent quality.This method is more comprehensive response to the difference between different Sophora processed products can be used to evaluate the quality of processed products Sophora.

Keywords：Sophora flavercens Ait.； Sophora alkaloids； Processing； Fingerprint； Quality control

苦参是豆科植物苦参Sophora flavercens Ait.的干燥根[1] 。一般在春天和秋天采挖，去除掉苦参的根头及小支根，洗干净，干燥后趁鲜切片。可用于热痢、黄疸尿闭、便血、赤白带下、阴肿阴痒、皮肤瘙痒、湿疹、外治滴虫性阴道炎等病症，是我国的常用传统中药材。由于中药材大多都是生药，多附有泥土或其他异物，或有异味、有毒性、潮湿等不宜于保存，经过一定的炮制处理，可以达到使药物纯净、矫味、降低毒性和干燥而不变质，加强药物效用的目的，减除毒性或副作用，便于储存和便于服用[2-4]。笔者对苦参药材的不同炮制方法进行研究并测定苦参生物碱含量，采用高效液相色谱法对苦参药材提取物的5种不同生物碱进行分离及用中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版软件进行图谱对比，为苦参不同炮制原理及炮制品质量评价提供合理的依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 METTLERTOLEDO电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；AS系列超声波清洗机（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；Q-250B高速多功能粉碎机（上海冰都电器有限公司）；HH-Z数显恒温水浴锅（常州奥华仪器有限公司）；DROGON移液枪（上海恒奇有限公司）；Agilent1200高效液相色谱仪（LC-2010c），G1314B VWD检测器，“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（A版）数据处理软件。

1.2 药品和试剂 苦参根采购于药材市场，经贵州医科大学药用植物与生药学教研室常楚瑞副教授鉴定为苦参Sophora flavercens Ait.的干燥根；苦参碱（批号：110805-200508）、氧化苦参碱（批号：110780-201007）、槐定碱标准品（批号：110784-200804）购自中国食品药品检定研究院；槐果碱（批号：Z25A16L17029）、氧化槐果碱（批号：Z18S6B3547）标准品购自上海源叶生物科技有限公司；乙腈、乙醇为色谱纯，水为自制超纯水；甲醇、磷酸、三氯甲烷等试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取槐果碱、苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、氧化槐果碱对照品，用甲醇溶解并制成含槐果碱0.02288 mg/mL、苦参碱0.0832 mg/mL、氧化苦参碱0.4912 mg/mL、槐定碱0.1044 mg/mL、氧化槐果碱0.3762 mg/mL的对照品储备液。

2.2 炮制方法 S1生品：取苦参药材150 g，用粉碎机打成细粉，过3号筛（60目）后封存。

S2炒黄品：取苦参生品150 g，置于热锅中，用文火炒至较原色加深时，取出称量得143.4 g，打成细粉，过3号筛（60目）后封存备用。

S3炒焦品：称取150 g苦参生品，置于热锅中，用文火加热，不断翻炒，炒至药物表面焦褐色并具有焦香气，取出称量得135.8 g，打成粉末，过3号筛（60目）后封存。

S4炒炭品：称取150 g苦参置于热锅中，用武火加热，不断翻动，炒至表面焦黑色，内部焦褐色时，取出称量得123.0 g，打成粉末，过3号筛（60目）后封存。

S5醋炙品：按照苦参：醋（5∶1，g/v），取苦参150 g，加醋拌匀，闷透，待醋被吸进尽后，取出称量得200.0 g，置于热锅内，用文火炒至微干，取出干燥，打成细粉，过3号筛（60目）后封存。

S6酒炙品：按照苦参：酒（3∶1，g/v），取150 g苦参片加酒搅拌，使药材全部闷透，待酒被吸进尽后，取出称量得190.4 g，置于热锅中炒干，打成细粉，过3号筛（60目）后封存。

S7麸炒品：按照苦参：麸皮片（1∶4，g/g），称取200 g麸皮，撒于热锅中，加热至冒烟时，放入50 g苦参片，迅速翻动，炒至药材表面颜色变深时，溢出焦香气，取出筛去麸皮后称量得45.8 g，打成细粉，过3号筛（60目）后封存。

S8蒸炙品：取150 g苦参片置于蒸制容器里隔水加热，蒸6 h后取出干燥，打成细粉，过3号筛（60目）后封存。

2.3 供试品溶液的配制 分别取苦参的不同炮制品约0.3 g，精密称重后加到具塞锥形瓶中，精密加入浓氨试液1 mL，加入三氯甲烷20 mL。塞上瓶塞，进行超声处理（功率250 w，频率33 kHZ）30 min，取出冷却至室温，补足重量至20mL，摇匀，过滤，精密量滤液5 mL，经2 g的无水硫酸钠过滤，取续滤液在85℃水浴锅蒸干，用甲醇溶解定容到10 mL，備用。

2.4 紫外分光光度法测定苦参炮制品生物总碱含量与分析

2.4.1 线性考察 用微量进样器精密吸取苦参碱对照品溶液0、100、150、200、250、300 μL分别加入25 mL具塞试管中，85℃水浴蒸干，加入溴麝香草酚蓝缓冲液6 mL（pH=7.6）+CHCl36 mL，振摇，分层，以对照品溶液0 mL加入溴麝香草酚蓝缓冲液6 mL（pH=7.6）+CHCl36 mL试管为空白，在416 nm波长处测定其吸光度。求出回归方程。结果得到苦参总碱浓度A与吸光度X关系曲线的回归方程A=0.05629X-0.00356，相关系数r2=0.9993。结果表明本实验苦参碱在2.55～6.8 μg/mL有良好的线性关系。

2.4.2 精密度实验 分别取苦参碱对照品100 μL加到5个25 mL具塞试管中，同2.4.1项下方法进行测定其吸光度，连续测得5次，结果平均RSD为0.68%。

2.4.3 重复性实验 精密称定同一样品苦参粉末 6份分别为：0.3003、0.3006、0.3009、0.3004、0.3005 g，同2.3项下提取苦参生物总碱，同2.4.1项下方法进行测定其吸光度，生物总碱平均含量为0.3430 mg/g，RSD为0.97%。

2.4.4 稳定性实验 精密称定供试品的溶液，每隔30 min测定一次，持续4 h，生物总碱平均含量为0.3421 mg/g，计算得其RSD为1.9%，表明供试品溶液在4 h内稳定性好。

2.5 炮制品苦参生物碱含量测定 吸取苦参总碱提取物100 μL，按照2.4.1测定吸光度，样品结果见表1。 从表1得出苦参炮制品中各生物总碱含量大小为：炒炭品<醋炙品<蒸制品<炒黄品<炒焦品<生品<酒炙品<麸炒品，说明苦参不同炮制方法对苦参药材提取物的生物总碱有影响，且麸炒品的苦参生物总碱含量最高，酒炙品次之。

2.6 苦参炮制品HPLC指纹图谱方法学考察

2.6.1 色谱条件 Agilent1200 Inertsil NH2色谱柱（5 μm，4.6×250 mm）；流动相-乙腈-无水乙醇-3%磷酸（84∶10∶6）；检测波长为210 nm；流速为1.0 mL/mim；柱温：30℃；进样量：20 μL。

2.6.2 精密度试验 取供试品溶液20 μL，按照2.2.1色谱条件，连续进样5次，结果5个主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积RSD均不大于1.39%，符合色谱峰指纹图谱要求，精密度良好。

2.6.3 稳定性试验 取供试品溶液20 μL，按照2.2.1色谱条件，分别在0、2、4、8、10 h检测指纹图谱，结果5个主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均不大于2.47%，符合色谱峰指纹图谱要求，表明10 h内供试品溶液稳定性好。

2.6.4 重复性试验 取同一炮制品5份，精密称定0.3002、0.3007、0.3004、0.3001、0.3006 g按照2.3供试品方法制备溶液，按照2.6.1色谱条件，结果5个主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均不大于1.97%，符合色谱峰指纹图谱要求，表明该方法稳定、重现性好。

2.6.5 苦参炮制品HPLC指纹图谱构建与分析 几种苦参炮制品按“2.3”的方法制备供试品溶液，测定指纹图谱，图2为某一样品（酒炙品）在60 min的HPLC图谱，共有11个峰，色谱分离度较好。将几种苦参炮制品的指纹图谱数据按照中位数对照图谱生成方法导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，参照图谱为S1，选取时间窗宽度为0.3 min，采用中位数法计算，选定5个特征峰进行多点校正，自动匹配，生成的对照图谱R，通过图谱的比较，确定11个色谱峰为共有峰，图3为不同炮制品的HPLC指纹图谱。

不同炮制品的5个生物碱的相对保留时间和相对峰面积为表2、表3，5个对照品HPLC图谱见图4和不同苦参炮制品HPLC指纹图谱见图3。炒炭品1号峰为槐果碱和2号峰为苦参碱的峰面积较大，且出现了g1和g2的色谱峰；以及炒焦品的3号峰为氧化槐果碱和5号峰为氧化苦参碱的峰面积较大。表明炮制品中炒炭品1号（槐果碱）和2号（苦参碱）含量均增加；炒焦品中3号（氧化槐果碱）和5号峰（氧化苦参碱）含量均增加，共有峰的相对保留时间RSD均小于1.50%，符合指纹图谱要求。峰面积RSD为27%～154.52%，炮制品间5种生物碱的量有较大变化。

将生品和几种苦参炮制品的指纹图谱数据按照平均数对照图谱生成方法导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，自动匹配成功后生成对照图谱（见图2），进行相似度评价，将S1定为1.000，得出不同苦参炮制方法的指纹图谱相似度见表4。炮制品中炒炭品相似度为0.385%，其它炮制品相似度均大于0.720%，說明各批次间炮制品相似度差异较大。

3 讨论

采用紫外分光光度法进行总生物碱含量测定，苦参生物总碱含量结果显示麸炒品含量最高，认为苦参用辅料麸皮炒后利于生物碱的提取，炒炭品比生品含量低，可能由于温度过高又会使它生物碱含量被破坏。

不同苦参炮制品HPLC指纹图谱中，S4炒焦品出现g1和g2峰，认为炒炭品有些化学成分会增加，具体出现了哪些化学成分的变化，尚有待进一步研究。

在HPLC指纹图谱研究过程中，各色谱图基线相对平稳，各个炮制品色谱峰分离良好，并且各峰面积较为适宜。本文考察了苦参炮制品指纹图谱研究，利用指纹图谱相似度评价系统软件进行对比分析各个炮制品间的图谱比较，其中炒炭品相似度相对较小。结果表明苦参生品及7种炮制品之间指纹图谱存在一定差异，主要表现在化学成分含量的增加或者减少，说明苦参不同炮制方法对其含主要化学成分只有量变无质变影响。因此，本试验可以为苦参炮制工艺的优化提供参考依据。

综上，苦参生品及7种炮制品之间指纹图谱存在一定差异，主要表现在化学成分含量的增加或者减少。参中主要生物碱成分差异不大，但其量有变化，炮制品的品质不一致，此方法较全面地反应苦参不同炮制品的差异，可用于评价苦参炮制品的质量。

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