钝药野木瓜中三萜类化合物分离及其含量测定

胡冬群 王霞 危英 伍庆 李亚楠 赵强 杜江

【摘 要】 目的： 研究民族药钝药野木瓜中三萜类化合物分离及其含量测定。方法：采用多种层析技术进行分离纯化，根据理化性质、波谱数据并与文献对照确定化合物结构；建立HPLC法同时测定钝药野木瓜中羽扇豆醇和羽扇豆酮含量的方法。结果：从钝药野木瓜藤茎的乙酸乙酯提取物中分离得到4个化合物，分别鉴定为羽扇豆酮（1），羽扇豆醇（2），3β-乙酰基齐墩果酸（3）和齐墩果酸（4）；其中羽扇豆醇和羽扇豆酮分别在0.5172～12.93 μg（r=0.9995）和0.945～ 23.625 μg（r=0.9992）范围内线性关系良好，平均加样回收率为97.4%和96.3%，RSD为2.4%和1.6%。结论：化合物 1～4为首次从钝药野木瓜中分离得到；贵州省8个不同产地、10批次的钝药野木瓜药材中，丹寨和贵定地区样品中羽扇豆醇和羽扇豆酮的含量最高，分别为0.0113 mg/g和0.0708 mg/g。实验结果为钝药野木瓜药材质量标准的建立和相关研究与应用提供科学依据。

【关键词】 钝药野木瓜；三萜；化学成分；含量测定

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2018）04-0009-05

Abstract：Objective To investigate and quantitative analysis of triterpenes from Stauntonia leucantha Dieles. Methods Different chromatographic techniques were applied to separate and purify the compounds. On the basis of physicochemical properties and spectral data， their structures were identified. HPLC was performed to analysis of lupeol and lupeone in S.leucantha Diels. Results Four known compounds were isolated and identified as lupeone （1） ， 3β-O-acetyloleanolic acid （2） ， lupeol （3） and oleanolic acid （4） from ethyl acetate extract. HPLC results showed that the linear ranges of lupeol and lupeone were 0.5172～12.93 μg （r=0.9995） and 0.945～23.625 μg （r=0.9992）， the average recoveries of two ingredients were 97.4% and 96.3% as well as RSD is 2.4% and 1.6%， respectively. Conclusion Compounds 1～4 were isolated from this plant for the first time. The highest contents samples which were collected from Danzai and Guiding areas among ten samples came from eight different areas in Guizhou province， contained lupeol and lupeone were 0.0113 mg/g and 0.0708 mg/g， respectively. This results could give a scientific basis for further development and utilization of medicinal S. leucantha Diels .

Keywords：Stauntonia leucantha Diels； Triterpenoid； Chemical constituents； Content determination.

鈍药野木瓜（Stauntonia leucantha Diels ex Y.C.）属于木通科野木瓜属植物，俗称绕绕藤、五叶木通、八月瓜，主要分布在贵州、四川、安徽、江浙和两广一带，具有祛风止痛，利尿消肿的功效，对风湿痹通、小便不利和水肿疗效显著[1]。该药材被2003版《贵州省中药材、民族药材质量标准》收载，作为野木瓜藤入药，但仅有性状描述[2]。在长期研究抗病毒中药和民族药的过程中，采用HIV-1蛋白酶和HPLC法[3]，发现钝药野木瓜95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物在100 μg/mL时，对HIV蛋白酶的抑制率达44.3%，进一步的文献调研发现，钝药野木瓜化学成分及含量研究未见报道。2015 版《中国药典》同属植物野木瓜（S.chinensis DC）以苯乙醇苷类成分荷苞花苷B作为指标性成分进行质量控制[4]。本课题组参照药典方法对黔产10批次的钝药野木瓜药材中荷苞花苷B进行定性和定量研究，发现含量为5.91～39.39 μg/g，荷苞花苷B需低温存放，长时间暴露在空气中，含量有所下降，其标准品溶液低温存放超过24h后，易产生杂质峰[5]。一些学者对野木瓜（S.chinensis DC）中的木犀草素、绿原酸、齐墩果酸和熊果酸的含量进行了报道[6-8]，而同属植物化学成分研究发现野木瓜（S.chinensis DC）[9]、六叶野木瓜（S.hexaphylla Thunb.Dence.）、五指那藤（S.obovatifoliola subsp.intermedia）、尾叶那藤（S.obovatifoliolasp.urophylla）和黄腊果（S.brachyanthera）藤茎中常分离出羽扇豆醇和羽扇豆酮等多种羽扇豆烷型化合物[9-11]。体内外研究证实，羽扇豆醇具抗炎、抗疟疾、抗癌等作用[12]。羽扇豆酮对单纯疱疹病毒（HSV）和非洲猪瘟病毒（ASFV）具有抗病毒活性，对HSV-1和HSV-2具有很强的抗病毒抑癍作用[13]。为明确钝药野木瓜药效物质基础，实验开展了钝药野木瓜化学成分研究，建立HPLC法同时测定羽扇豆醇和羽扇豆酮的定量分析方法，为该药材的监督、质控和相关药品、保健品的开发研制提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Bruker AM-400和500 MHz核磁共振波谱仪（TMS为内标）；GC-MS 5973型气相色谱质谱联用仪（美国HP公司）；1100型高效液相色谱仪（ 美国 Agilent）；梅特勒-托利多超声波清洗器（METILER-TOULEDO）；ME104 电子分析天平（瑞士梅特勒）；R-200旋转蒸发仪（瑞士布奇公司）；SHZ-DⅢ循环水式真空泵（上海予英仪器有限公司）；ZF-1三用紫外分析仪（上海电光分析）。

1.2 材料 TLC和柱色谱硅胶分别为GF254和200-300目硅胶 （青岛海洋化工厂分厂）；反相硅胶为ODS DM 1020T （日本富士硅胶公司）；Sephadex LH-20 （GE 公司）。羽扇豆醇、羽扇豆烷均来自为本植物（乙酸乙酯萃取）分离纯化所得，结构经波谱学（ESI-MS，1H-NMR，13C-NMR）分析鉴定，以HPLC面积归一化法测定其质量分数均大于96%。洗脱剂均为工业重蒸品，甲醇、乙醇、磷酸（分析纯，重庆茂业化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；水（超纯水）。钝药野木瓜药材于2014年4月采集于贵州省遵义市，经贵阳中医学院陈德媛教授鉴定为钝药野木瓜的地上部分，凭证标本保存于贵阳中医学院中药化学教研室（标本号：2014/SL）。

2 方法与结果

2.1 化学成分研究

2.1.1 药材前处理 干燥钝药野木瓜藤茎 3 kg，粉碎后用70%的甲醇溶液（料液比为 1∶3）加热回流提取3次，每次1 h，合并浸提液后减压浓缩，回收甲醇至无醇味，再用乙酸乙酯萃取，浓缩，得浸膏（45 g），经硅胶柱（柱长×内径=75 cm × 5.5 cm ）色谱进行分离。以石油醚-乙酸乙酯（40∶1 → 0∶100）进行梯度洗脱，最后用氯仿-甲醇（1∶1）混合液及纯甲醇下柱，得 35 个流份（fr.1～ 35）。

2.1.2 化合物的分离纯化 在fr.3，即 石油醚-乙酸乙酯 25∶1 部分（112 mg）经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，以氯仿-甲醇（1∶1）为洗脱剂，纯化得到化合物 1（27 mg）；fr. 18，即石油醚-乙酸乙酯 20∶1～18∶1部分（106 mg）经反相硅胶柱层析，以甲醇-水（5∶5 → 10∶0）梯度洗脱，在 8∶2 洗脱部分析出结晶，用甲醇多次洗涤结晶，石油醚-丙酮重结晶得化合物2（19 mg）；fr.26，即石油醚-乙酸乙酯（15∶1 ～ 12∶1部分（363 mg）经硅胶柱层析分离，用石油醚-丙酮（30∶1→1∶1）梯度洗脱得到 12 个流份，其中fr.5 ～ 6经Sephadex LH-20柱层析，甲醇洗脱分离纯化得到化合物 3（26.7 mg）；fr.30，即石油醚-乙酸乙酯10∶1～9∶1部分（163 mg）经硅胶柱层析，用氯仿-丙酮（40∶1→1∶1）洗脱，并经石油醚-丙酮重结晶得到化合物 4（25.2 mg）

2.1.3 化合物的结构鉴定 化合物 1 白色结晶（丙酮），mp 170～172 ℃，分子式为C30H48O； ESI-MS m/z 447 [M + 23]+；H-NMR （CDCl3， 400 MHz） 、13C-NMR （CDCl3， 100 MHz） 数据与文献[14] 对照基本一致，故鉴定化合物 1 为羽扇豆酮。

化合物 2 白色针晶（石油醚-丙酮）；EI-MS m/z 488 [M]+，H-NMR （CDCl3，500 MHz）、13C-NMR （CDCl3， 125 MHz）數据与文献[15]报道基本一致，故鉴定该化合物2为3β-乙酰基齐墩果酸。

化合物 3 白色针状结晶（石油醚-醋酸乙酯）， mp 210 ～ 212 ℃，分子式为C30H50O， TLC检识遇硫酸-甲醇溶液加热显紫红色， Lieberman-Burchard反应为阳性。EI-MS m/z 426 [M]+ ，H-NMR （CDCl3， 400 MHz） 、13C-NMR （CDCl3， 100 MHz）数据与文献[16] 对照基本一致，故鉴定化合物 3 为羽扇豆醇。

化合物 4 白色簇晶（石油醚-丙酮）；EI-MS m/z 456 [M]+，H-NMR （CDCl3， 400 MHz） 、13C-NMR （CDCl3， 100 MHz）数据与文献[17]报道基本一致，故鉴定该化合物4为齐墩果酸。

2.2 羽扇豆醇与羽扇豆酮的含量测定

2.2.1 色谱条件及系统适应性 色谱柱为Ocean C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流动相：100%甲醇；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；紫外检测波长：210 nm；进样量为20 μL。对照品与样品中的羽扇豆醇和羽扇豆酮色谱峰相互分离度大于1.5，理论塔板数大于5000，对照品和钝药野木瓜样品的HPLC色谱见图 1。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取羽扇豆醇对照品12.930 mg和羽扇豆酮对照品23.625 mg于25 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀释至刻度，制成浓度分别为0.5172 mg/mL和0.945 mg/mL对照品贮备液。分别精密吸取上述对照品贮备液适量，加甲醇溶解并稀释，摇匀，制成羽扇豆醇和羽扇豆酮质量浓度分别为0.0517 mg/mL和0.0945 mg/mL的混合对照品溶液，备用。

2.2.3 供试品溶液的制备 取钝药野木瓜干燥带叶茎枝药材粉末（贵州都匀，过4号筛，50℃烘干）约1.0 g，精密称定，置于150 mL具塞锥形瓶中，用移液管精密加入甲醇25 mL，密塞，摇匀，称重，超声提取30 min，待冷却后，称重，用甲醇补足减量，经4000 r/min离心15 min，取上清液过0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.2.4 标准曲线的考察 分别精密吸取上述两种对照品贮备液1、5、10、15、20、25 μL，按2.2.1项下色谱条件分别进样，记录色谱图，以进样量（X，μg）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标进行回归，得羽扇豆醇回归方程为 Y=20.026X-6.1885（r=0.9995，n=6），进样量在0.5172～12.93 μg范围内线性关系良好；回归方程为羽扇豆酮Y=7.6074X+2.6331（r=0.9992，n=6），进样量在0.945～23.625 μg范围内线性关系良好。见图2～3。

2.2.5 精密度试验 分别精密吸取2.2.2项下对照品混合溶液20 μL，按2.2.1色谱条件各连续进样6次，测定峰面积，计算RSD分别为0.9%和0.3%，表明仪器的精密度良好。

2.2.6 重复性试验 精密称取同一批钝药野木瓜粉末（贵州都匀，过4号筛）6份，每份1.0 g，按供试品溶液的制备方法制备溶液，取供试品溶液20 μL进样，在上述色谱条件下进行分析，根据峰面积代入回归方程计算质量，得羽扇豆醇和羽扇豆酮RSD分别为1.2%（n=6）和0.8%（n=6）。

2.2.7 稳定性试验 精密称取钝药野木瓜粉末（贵州都匀，过4号筛）约1.0 g，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，室温下放置，取供试品溶液20μL，分别在0、2、4、6、8、10、12 h进样分析，分别测定峰面积。结果羽扇豆醇和羽扇豆酮峰面积的RSD分别为2.0%和1.5%。表明12 h内供试品溶液的稳定性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取钝药野木瓜粉末（贵州都匀，过4号筛）约0.5 g，各加入对照品适量，按2.2.3项下方法制备样品溶液，分别吸取20 μL进样分析，测定羽扇豆醇、羽扇豆酮的含量，计算加样回收率。见表1。

2.2.9 样品分析 取贵州省3个地区钝药野木瓜的茎和全株，8个地区钝药野木瓜的全株，打成粉末（过4号筛）精密称定1.0 g，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样，记录峰面积，外标一点法计算药材中羽扇豆醇和羽扇豆酮的含量。实验结果见表2～3。

3 讨论

3.1 实验条件的优化 实验考察了甲醇-水、乙腈-水3个不同比例为检测体系，结果发现目标峰出峰较晚，甚至不出峰，而甲醇-水（98∶2）首个目标峰出峰时间接近1 h，用乙腈替换也没明显改善出峰时间，而用纯甲醇作为流动相时，两个目标峰羽扇豆醇、羽扇豆酮的出峰时间明显缩短且分离效果好，故选择了纯甲醇作为流动相。

3.2 样品处理方法的选择 实验考察了不同溶剂（甲醇、乙醇、氯仿及氯仿-甲醇）作为提取溶剂，结果发现甲醇作为提取溶剂提取率相对较高，氯仿-甲醇（1∶1）及氯仿次之，乙醇作为提取溶剂时目标峰分离效果不好，故选用甲醇作为提取溶剂，同时本实验也考察了不同浓度甲醇（100%、90%、80%、75%、65%），不同提取方法（超声提取法、回流提取法、冷浸提取法），不同提取时间（0 min、30 min、40 min、50 min、60 min），不同料液比（15倍、25倍、35倍、45倍体积），最终确定以100%甲醇为提取溶剂，超声提取30 min，料液比为25倍时样品提取率相对较高且操作简便，故为最优处理方法。

3.3 样品含量测定 由表2可知，钝药野木瓜全株植物中的羽扇豆醇含量均高于纯茎部位，可能该植物的叶子含有较大量的羽扇豆醇成分，而羽扇豆酮的含量受植株部位的影响较小；由表3中结果显示，羽扇豆醇的含量受植物生长环境的影响较小，但不同产地还是存在差异，贵州丹寨地区的钝药野木瓜中羽扇豆醇含量最高，为0.0113 mg/g；羽扇豆酮的含量差异较大，植株受生长环境因素影响较大，并且贵州贵定地区的钝药野木瓜中羽扇豆酮与总三萜的含量最高，分别为0.0708 mg/g和0.0794 mg/g。贵州省8个不同产地、10批次的药材中，丹寨和贵定地区样品的羽扇豆醇和羽扇豆酮含量最高，分别为0.0113 mg·g-1和0.0708 mg·g-1。

实验首次从钝药野木瓜中分离、纯化和鉴定出4种五环三萜化合物，并建立HPLC法同时测定钝药野木瓜药材中羽扇豆醇和羽扇豆酮的含量，分析方法简单、可行，研究结果为钝药野木瓜药材的开发利用提供科学依据。

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