氯沙坦通过AT1R/VEGF信号通路对肝癌血管生成的影响

武荣，张俊涛，李卫斌，王坤，刘志贞

（1.临汾职业技术学院 预防医学教研室，山西 临汾 041000；2.山西医科大学 生物化学与分子生物学教研室，山西 太原 030001；3.山西大医院 普外科，山西 太原 030032；4.山西省太原市第三人民医院 肝病二科，山西 太原 030012）

全世界范围内肝癌的发病率排第6位，死亡率排第3位[1-2]。微血管密度（microvessel density, MVD）被认为是肝癌和其他癌症预后的一个重要指标[3]。AngⅡ 1型受体（angiotensin Ⅱ receptor 1, AT1R）阻抑剂氯沙坦具有抗高血压的作用[4-5]。黑色素瘤[6]、胰腺癌[7]、肾癌[8]和膀胱癌[9]都表达AT1R。实验发现，AT1R拮抗剂可以抑制AT1R表达的肿瘤血管生成，但机制尚不清楚[10]。本实验检测癌细胞和大鼠肝癌组织中AT1R的表达，研究氯沙坦对血管生成的作用，从而证明AT1R为肝癌肿瘤血管生成的有效靶点。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

AngⅡ、氯沙坦、Hoechst、蛋白提取试剂盒购自美国Sigma公司，胎牛血清、DMEM、MEM培养基购自美国Gibco公司，AT1R一抗、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）一抗、CD34一抗购自美国Abcam公司，VEGF ELISA kit（美国Pepro Tech公司）。

1.2 细胞

肝癌细胞系HepG2、HuH-7和PLC/PRF/5，以及正常肝细胞LO2购自中国科学院上海细胞库。

1.3 实验动物

健康雄性SD大鼠24只，体重230～250 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司（合格证：C57B/L-B6D2F1/Crl，302），在动物实验中心无菌培养室内饲养。所做处理均符合郑州大学动物伦理中心制定的章程。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 HepG2和HuH-7培养于10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养液中，PLC/PRF/5和LO2培养于10%胎牛血清、1%双抗MEM培养液中。将其放置于在37℃、5%二氧化碳CO2，相对湿度95%的培养箱中培养。

1.4.2 大鼠肝癌模型的复制 将24只大鼠麻醉，腹腔注射10%水合氯醛，0.1 ml/只。大鼠取仰卧位，将其四肢固定于实验板上，用剪子小心剃去胸腹部毛后擦拭安尔碘消毒，沿腹白线逐层开腹，暴露腹腔，轻压胸腔后，肝脏暴露出腹腔，选取最接近体表的肝叶种植肿瘤。用注射针头斜行进针，刺入肝脏约1 cm，轻推注射器针芯，缓慢注入细胞悬液20μl，约1×106个HepG2细胞，缓慢退针，用无菌棉签轻压片刻后轻送肝脏进入腹腔，逐层关腹。继续饲养大鼠，待成瘤模型复制成功后（皮下结节直径＜0.5 cm为成瘤标准），开始给大鼠（其中12只）喂药氯沙坦（5 mg/kg），持续给药2周，处死大鼠，取肝癌组织进行实验。

1.4.3 Western blot检测 将肝癌细胞系HepG2、HuH-7和PLC/PRF/5，以及正常肝细胞LO2培养于75 mm2培养瓶中，待细胞长大约90%时，用细胞刮刀刮下，冰上裂解提取蛋白。将HepG2细胞按1×106个/孔接种于6孔板，待细胞长到对数生长期时，分别添加0、1、10、100和1 000 nmol/L AngⅡ，100 nmol/L AngⅡ＋0.1μmol/L氯沙坦，100 nmol/L AngⅡ＋1.0μmol/L氯沙坦，1 000 nmol/L AngⅡ＋10.0μmol/L氯沙坦，培养24 h。用细胞刮刀刮下细胞，冰上裂解提取蛋白，用二喹啉甲酸法测定每组蛋白质浓度，总蛋白上样量为35μg/孔，上完样后进行12%SDS-PAGE凝胶电泳分离后转膜（80 V，90 min），5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST洗膜5 min/次，共5次。分别用一抗 AT1R（1 ∶ 500）、GAPDH（1 ∶ 1 000）4℃过夜，TBST洗膜5 min/次，共5次。用稀释比例为1∶1 000的羊抗兔二抗37℃摇床反应1 h，TBST洗膜5 min/次，共5次。采用ECL试剂盒进行显色，凝胶成像分析系统拍照后，用Lab Works 4.6软件进行灰度值分析。

1.4.4 酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA） 将 HepG2细胞按 1×106个 /孔接种于6孔板，细胞贴壁12 h后，用无血清的DMEM培养12 h，添加100 nmol/L AngⅡ、100 nmol/L AngⅡ＋0.1μmol/L氯沙坦、100 nmol/L AngⅡ＋1.0μmol/L氯沙坦、1 000nmol/L AngⅡ＋10.0μmol/L氯沙坦，培养24 h。吸取培养液于离心管中，3 500 r/min离心10 min，取上清液。VEGF的检测按照VEGF ELISA kit试剂盒说明书进行操作。

1.4.5 免疫组织化学法 取大鼠肝癌组织制成切片，将切片固定于载玻片上干燥处理。将石蜡切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中进行脱蜡，然后逐级放置于100%纯酒精Ⅰ、Ⅱ，95%、80%和70%酒精，以及水中各5 min，进行水化。水化后的切片放于3%双氧水 H2O2中室温孵育10 min，PBS洗涤3次。将切片放入柠檬酸缓冲液（0.01 nmol/L，pH 6.0）中，加热至沸腾改中火（＞92℃），室温下复温，PBS洗涤3次。吸干多余液体，滴加山羊血清封闭液，37℃孵育30 min。分别滴加AT1R（1 ∶ 300）、VEGF（1 ∶ 800）和 CD34（1 ∶ 600）一抗4℃过夜，取出后在37℃烤箱中复温30 min，PBST洗3次。滴加生物素抗兔二抗，37℃孵育1 min，PBST洗涤3次。用DAB试剂盒显色10 min，显色终止后清洗切片。滴加苏木精室温染液3 min，清水洗掉苏木精染液，盐酸酒精分化1 s，氨水返蓝5 min。将切片分别放入70%和80%酒精各1 min，90%酒精2 min，95%酒精3 min，100%酒精Ⅰ、Ⅱ各3 min。二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15 min，取出晾干后用中性树胶封片。每个标本以只滴加PBS液作为阴性对照，在显微镜下观察各切片着色情况。

1.4.6 免疫荧光染色 将盖玻片放到6孔板中，肝癌细胞系HepG2、HuH-7和PLC/PRF/5，以及正常肝细胞LO2均按1×105个/ml接种于6孔板中，待细胞长至80%时，弃上清，PBS洗3次，10 min/次。4%多聚甲醛室温固定细胞20 min，PBS洗3次，添加0.1%Triton X-100细胞打孔，1%胎牛血清白蛋白封闭，加入AT1R（1∶500）抗体4℃过夜，PBS洗3次，加入FITC标记的羊抗鼠二抗和Hoechst，室温孵育1 h，将盖玻片放到载玻片上，荧光显微镜下观察拍照。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AT1R在各细胞系中的表达

荧光显微镜下观察AT1R在肝癌细胞系HepG2、HuH-7和PLC/PRF/5，以及正常肝细胞LO2中的表达，发现AT1R在正常肝细胞LO2中绿色荧光强度低，而在肝癌细胞系HepG2、HuH-7和PLC/PRF/5中绿色荧光强度高，在HepG2细胞中绿色荧光最强，即AT1R在HepG2细胞中表达最高。见图1。

图1 AT1R在各细胞系中的表达 （荧光显微镜×100）

2.2 AT1R蛋白在各细胞系中的表达

为进一步证明荧光显微镜的观察结果，采用Western blot检测AT1R在肝癌细胞系HepG2、HuH-7和PLC/PRF/5，以及正常肝细胞LO2中的表达，其相对表达量分别为（1.00±0.03）、（0.37±0.02）、（0.36±0.02）、（0.11±0.02），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=829.274，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，AT1R在正常肝细胞LO2中低表达，在肝癌细胞系HepG2中高表达（t=1.874，P=0.008），在HuH-7和PLC/PRF/5中高表达（t=1.272和 1.568，P=0.032 和 0.019）。见图2。

图2 AT1R蛋白在各细胞系中的表达 （±s）

2.3 氯沙坦对肝癌细胞系HepG2中AT1R蛋白表达的影响

上述实验表明AT1R在肝癌细胞系HepG2中表达最高，故进一步用Western blot检测氯沙坦对肝癌细胞系HepG2中AT1R表达的影响。0、1、10、100和1 000 nmol/L AngⅡ浓度组的AT1R蛋白相对表达量分别为（0.10±0.01）、（0.14±0.02）、（0.25±0.03）、（0.36±0.03）、（0.51±0.03），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=131.774，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，0 nmol/L与1 nmol/L AngⅡ比较，差异无统计学意义（t=0.325，P=0.078）；与0 nmol/L AngⅡ相比，从10 nmol/L AngⅡ开始，随着AngⅡ浓度增加，AT1R蛋白表达量逐渐升高（t=1.643、3.428和 2.953，P=0.014、0.000 和 0.000）。见图3。

图3 不同浓度AngⅡ对肝癌细胞系HepG2中AT1R蛋白的表达的影响 （±s）

0 nmol/L AngⅡ＋0.0μmol/L氯沙坦、100 nmol/L AngⅡ＋0.0μmol/L氯沙坦、100 nmol/L AngⅡ＋0.1μmol/L氯沙坦、100 nmol/L AngⅡ＋1.0μmol/L氯沙坦、1 000 nmol/L AngⅡ＋10.0μmol/L氯沙坦组的AT1R 相对表达量分别为（0.21±0.02）、（0.84±0.03）、（0.52±0.02）、（0.31±0.03）、（0.29±0.03），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=281.878，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，与100 nmol/L AngⅡ＋0.0μmol/L氯沙坦组相比，随着氯沙坦浓度增加，AT1R蛋白表达水平逐渐降低（t=2.953、4.058和3.194，均P=0.000）。见图4。

2.4 氯沙坦对肝癌细胞系HepG2中VEGF的影响

图4 不同浓度AngⅡ＋氯沙坦对肝癌细胞系HepG2中AT1R蛋白表达的影响 （±s）

AngⅡ ＋ 0.0μmol/L氯沙坦、100 nmol/L AngⅡ ＋0.1μmol/L氯沙坦、100 nmol/L AngⅡ＋1.0μmol/L氯沙坦、1 000 nmol/L AngⅡ＋10.0μmol/L氯沙坦组的VEGF表达量分别为（730.1±10.0）、（806.6±18.1）、（789.0±12.0）、（780.8±1.0）、（769.7±1.0），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=21.322，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，100 nmol/L AngⅡ＋0.0μmol/L氯沙坦组较0 nmol/L AngⅡ＋0.0μmol/L氯沙坦组的VEGF表达量增加（t=1.215，P=0.041）；与100 nmol/L AngⅡ＋0.0μmol/L氯沙坦组比较，当氯沙坦的浓度为1.0μmol/L时，VEGF的表达量降低（t=1.383，P=0.030）；当氯沙坦的浓度为10.0μmol/L时，VEGF的表达量进一步降低（t=1.407，P=0.028）。见图5。

2.5 氯沙坦对大鼠肝癌组织中AT1R、VEGF及CD34表达的影响

免疫组织化学法检测结果显示，氯沙坦对AT1R、VEGF及CD34的表达有较明显的影响（见图6）。对照组和氯沙坦组的AT1R阳性表达率分别为（62.07±3.86）%和（43.57±4.21）%，经t检验，差异有统计学意义（t=1.920，P=0.034），氯沙坦组较低（见图7）。对照组和氯沙坦组的VEGF阳性表达率分别为（57.38±6.16）%和（19.87±3.29）%，经t检验，差异有统计学意义（t=2.963，P=0.000），氯沙坦组较低（见图8）。对照组和氯沙坦组的AT1R阳性表达率分别为（56.83±5.17）%和（17.56±3.12）%，经t检验，差异有统计学意义（t=3.536，P=0.000），氯沙坦组较低（见图9）。

图5 氯沙坦对肝癌细胞系HepG2中VEGF的影响 （±s）

图6 大鼠肝癌组织中AT1R、VEGF及CD34的阳性表达 （免疫组织化学法×800）

图7 氯沙坦对大鼠肝癌组织中AT1R表达的影响 （±s）

图8 氯沙坦对大鼠肝癌组织中VEGF表达的影响 （±s）

图9 氯沙坦对大鼠肝癌组织中CD34表达的影响 （±s）

3 讨论

AT1R在乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌等各种恶性肿瘤中表达[11]。有报道表明，AT1R参与多种动物模型中肿瘤的发生、发展[12]。但是在人肝癌细胞中，AT1R的表达报道甚少。FAN等[13]证明，AT1R在肝癌细胞系中高表达，其与肝癌的血管生成相关。本研究通过体内外实验证明AT1R阻断剂氯沙坦对肝癌血管生成的影响。免疫组织化学法结果表明，肝癌细胞中均有AT1R的表达，同时VEGF在肝癌细胞中的表达趋势与AT1R一致。VEGF是由肿瘤细胞分泌的、重要的血管生成刺激因子，同时VEGF的表达与肝癌预后有关。通过上调VEGF可以刺激血管的生成，AngⅡ通过与G蛋白偶联受体AT1R结合，介导很多细胞效应。因此，AngⅡ-AT1R-VEGF系统在控制肝癌细胞血管生成中有重要作用。

除了VEGF，肿瘤内的MVD也是评估恶性肿瘤患者预后的重要定量参数。CD31、CD34、vWF为鉴定MVD的上皮细胞特异性标志[14]。MVD与AT1R的表达呈正相关，约70%高MVD样本中，AT1R有高表达现象。MVD可以有效反映肿瘤血管的生成。并且MVD的增加与VEGF表达呈正相关[15]。笔者推测，AT1R对肝癌血管的生成具有重要作用，所以AT1R对调节VEGF-A具有重要作用。血管生成已成为药物治疗的一个重要的靶点，许多血管生成抑制药物已经用于临床。在本研究中，AngⅡ通过上调AT1R蛋白表达来促进肝癌细胞中VEGF的产生，同时氯沙坦可以抑制该现象。本研究同时证明，氯沙坦可以有效抑制肿瘤的生长和VEGF的表达。作为AT1R的抑制剂，氯沙坦可以抑制体内固体瘤的生长，这种抑制可能是通过抑制血管生成介导的。

AT1R参与癌细胞增殖。但是SUGANUMA等[16]实验表明，AngⅡ不能有效地促进卵巢癌细胞的增殖。同时在本实验中，AngⅡ可以增加VEGF的分泌，AT1R也许没有直接参与肝癌细胞的增殖，并且血管紧张素Ⅱ-AT1R体系在不同类型肿瘤细胞的发展过程中也起到不同的作用。

综上所述，本研究结果表明，AT1R表达于肝癌细胞中，并与肿瘤血管生成有关。AT1R的抑制剂可以抑制实验动物模型中肿瘤血管的生成。尽管如此，AT1R阻抑剂氯沙坦的实验结果表明，氯沙坦既无直接的毒性作用，也无抗增殖的作用。根据体内外实验结果，笔者将氯沙坦的抗肿瘤作用归结于抗血管的生成作用，而不是直接的毒性作用。AT1R不仅是一个很有潜力的预后指示因子，而且是肝癌治疗的一个重要靶点。