氯美噻唑对乙醇诱导大鼠肝损伤的抑制作用研究

王剑彬，吴彩月，王丽斯，吴恺明

（1.广州医科大学附属乐从医院 消化科，广东 佛山 528315；2.广东省佛山市顺德区乐从社区卫生服务中心，广东 佛山 528315；3.广州医科大学附属乐从医院 检验科，广东佛山 528315；4.中山大学附属第一医院 胃肠外科中心，广东 广州 510080）

氯美噻唑（Clormethiazole, CMZ）为噻唑类衍生物，具有镇静、催眠、抗惊厥作用[1]。肝损伤的主要病理形式包括酒精性肝炎、肝纤维化、肝硬化等，病因是长期大量饮酒诱导肝细胞色素P450 2E1（cytochrome P450 2E1, CYP2E1）的表达，增加自由基对肝脏的损伤[2-3]。研究表明，CMZ在翻译后抑制CYP2E1基因的转录，从而影响CYP2E1的活性[4-6]。本文通过复制慢性酒精性肝损伤大鼠模型，以期阐明CMZ在酒精所致肝细胞损伤中发挥的重要作用，为临床防治酒精性肝损伤提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 无特定病原体级雄性SD大鼠32只，体重（220±20）g，购自北京维通利华生物技术有限公司，合格证号SCXK-京-2016-0012。

1.1.2 药物试剂 CMZ纯度99.8%（上海梯希爱化成工业发展有限公司），氯唑沙宗（Chlorzoxazone, CHZ）纯度99%（上海梯希爱化成工业发展有限公司），43%乙醇（河南省化工试剂有限公司），Vector ABC试剂盒和丙二醛（Malondialdehyde, MDA）试剂盒购自南京建成生物工程有限公司，CYP2E1、CYP4A、CYP3A抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.1.3 实验仪器 CX23型光学显微镜（日本奥林巴斯公司），AU680型全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特公司），UV1901双光束紫外分光光度计（上海精学科学仪器有限公司），SONICS超声波细胞破碎仪（美国BRANSON公司），安捷伦1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司），ULTRACUTR型超薄切片机（德国莱卡公司），JA2003型电子分析天平（上海天平仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠慢性酒精性肝损伤模型的复制 按2个影响因素的析因设计分组：A干预因素：①不干预，②干预（给予CMZ）；B模型复制因素：①无损模型（给予葡萄糖），②损害模型（给予乙醇）（见表1）。32只雄性SD大鼠适应性饲养1周后，按体重均衡随机分为4组，每组8只。

表1 2个因素的析因设计

A2B1：葡萄糖＋CMZ组，用生理盐水将CMZ配制成所需浓度，大鼠灌胃CMZ 80 mg/（kg·d），2 h后灌胃 43% 葡萄糖 [0.1 ml/（kg·d）]，60 d。

A1B1：葡萄糖对照组（阴性对照组），大鼠灌胃葡萄糖＋CMZ组等体积生理盐水，2 h后灌胃43%葡萄糖液 [0.1 ml/（kg·d）]，60 d。

A2B2：乙醇＋CMZ组，用生理盐水将CMZ配制成所需浓度，大鼠灌胃CMZ 80 mg/（kg·d），2 h后灌胃 43% 乙醇 [0.1 ml/（kg·d）]，60 d。

A1B2：乙醇模型组（阳性对照组），大鼠灌胃乙醇＋CMZ组等体积生理盐水，2 h后灌胃43%乙醇[0.1 ml/（kg·d）]，60 d。

第60天，大鼠禁食但不禁水，12 h后在眼眶处采血，收集大鼠血浆，称体重。各组大鼠腹腔注射CHZ 150μmol/kg，分别于给药后1、2和3 h在眼眶处采集大鼠血样，随即断头处死。血液4 500 r/min离心10 min，储存于-20℃冰箱。取肝脏全叶并称重，其中一叶采用10%多聚甲醛固定，剩余部分冻存于-80℃冰箱。每组8只大鼠，实际每组模型复制成功6或7只，故最终实验按每组6只大鼠计算。

1.2.2 大鼠肝指数的计算及血浆乙醇浓度和血清谷丙转氨酶(alanine transaminase, ALT）活性的检测 计算各组大鼠的肝脏指数（肝重/体重）；采用全自动生化分析仪通过酶动力学方法测定ALT的活性；采用放射性能量衰变实验测定血浆乙醇浓度[7]。

1.2.3 大鼠肝组织病理学观察和分级 取用10%多聚甲醛固定的肝脏组织，常规石蜡包埋，4μm组织切片，苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining,HE）染色，光学显微镜下观察各组大鼠肝脏形态学变化；肝脏形态学病理分级参照MATHEWS等[8]的方法。

1.2.4 肝组织CYP2E1免疫组织化学法染色 CYP2E1免疫组织化学染色采用SP法[9]，DAB显色。一抗CYP2E1（1∶600稀释），使用Vector ABC试剂盒和生物素标记的二抗显现CYP2E1的阳性区域。

1.2.5 肝组织匀浆MDA含量的测定 在752型分光光度计上用分光光度法测定MDA含量，其浓度以pmol/mg匀浆蛋白表示。通过检测脂肪组织的MDA反映脂质过氧化程度，使用硫代巴比妥酸检测MDA[10]。

1.2.6 大鼠肝脏蛋白酶体活性的测定 制备肝匀浆，检测糜蛋白酶活性（LLVY-AMC水解程度）、类胰蛋白酶活性（LSTR-AMC水解程度）和谷氨酰肽水解酶活性（LLE-NA水解程度）[11]。在pH 7.5的0.1 mol Tris-HCl中加入20～200μg相同蛋白和40μmol缩氨酸，30℃恒温摇床反应1 h。LLVY-AMC和LSTRAMC的激发和发射检测波长分别为390和440 nm，β-甲萘胺的激发和发射检测波长分别为335和410 nm。

1.2.7 Western blot检测 将各组冻存的大鼠肝脏按照曹艳等[12]的方法制备成肝微粒体。使用大鼠多克隆抗体，采用Western blot检测大鼠CYP2E1、CYP3A、CYP4A蛋白相对表达量[13]。采用4%浓缩胶和8.7%分离胶行聚丙烯酰胺凝胶电泳。将肝微粒体溶解在聚丙烯酰胺凝胶缓冲液中（3% SDS，0.2 mol Tris-Hcl，pH 6.8，26%丙三醇，2 mol β-巯基乙醇）100℃加热2 min。按25μl/孔上样，微粒体蛋白电泳分离后电转移至PVDF膜，脱脂奶粉封闭1 h。一抗（1∶5 000稀释）室温孵育1 h；HRP标记的山羊抗兔二抗（1∶2 000稀释）室温孵育1 h。充分洗膜后加入ECL化学发光液，采用Image Quant LAS 4000型蛋白成像系统（德国GE Healthcare公司)进行曝光处理。实验结果以密度为单位来计算（UA/mg）。

1.2.8 大鼠体内CYP2E1活性的检测 通过高效液相色谱检测血浆样品中6-羟基氯唑沙宗和CHZ的含量（μg/ml），采用6-羟基氯唑沙宗/氯唑沙宗比值评估各组大鼠体内CHZ的代谢程度[14]。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析或析因设计的方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CMZ对酒精性肝损伤大鼠体重、肝脏指数及肝功指标的影响

实验期间（60 d），乙醇模型组和葡萄糖对照组大鼠以相同的速率成长（P＞0.05）。乙醇模型组平均增长体重3 g/d，葡萄糖对照组为2.2 g/d，乙醇＋CMZ组为1.5 g/d，葡萄糖＋CMZ组为2.1 g/d。乙醇与葡萄糖干预效果比较，差异有统计学意义（P＜0.05），乙醇模型组的肝重和相对肝重（相对肝重=肝重/体重×100%）高于葡萄糖对照组，但葡萄糖＋CMZ组的肝重和相对肝重较乙醇＋CMZ组降低。见表2。

表2 CMZ对酒精性肝损伤大鼠体重、肝脏指数的影响（n =6，±s）

表2 CMZ对酒精性肝损伤大鼠体重、肝脏指数的影响（n =6，±s）

组别 体重/g 肝重/g 相对肝重/%葡萄糖对照组 347±24 11.9±1.8 3.4±0.4乙醇模型组 372±38 18.8±2.9 5.0±0.3葡萄糖+CMZ组 340±31 13.3±1.4 3.9±0.3乙醇+CMZ组 301±61 16.6±5.0 5.4±0.9 FA值 5.465 0.093 4.087 PA值 0.030 0.764 0.057 FB值 0.172 16.017 50.086 PB值 0.683 0.001 0.000 FA×B值 3.762 1.905 0.051 PA×B值 0.067 0.183 0.824

2.2 CMZ对酒精性肝损伤大鼠肝功指标和血浆乙醇含量的影响

乙醇模型组血浆中乙醇浓度与乙醇＋CMZ组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。乙醇模型组与葡萄糖对照组的ALT水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。但乙醇模型组与乙醇＋CMZ组的ALT水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；葡萄糖对照组与葡萄糖＋CMZ组的ALT水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），表明CMZ的影响效果显著。见表3。

表3 CMZ对酒精性肝损伤大鼠肝功指标和血浆乙醇含量的影响 （n =6，±s）

表3 CMZ对酒精性肝损伤大鼠肝功指标和血浆乙醇含量的影响 （n =6，±s）

组别 乙醇/（mg/dl） ALT/（IU/L）葡萄糖对照组 - 90±40乙醇模型组 197±49 102±53葡萄糖+CMZ组 - 33±13乙醇+CMZ组 239±172 66±38 tA/FA值 0.575 8.674 PA值 0.586 0.008 FB值 2.037 PB值 0.169 FA×B值 0.436 PA×B 值 0.517

2.3 CMZ对酒精性肝损伤大鼠肝脏组织病理学变化的影响

乙醇模型组大鼠的病理分级高于乙醇＋CMZ组，乙醇模型组大鼠的肝脏病理分级参数（脂肪变性、坏死、炎症、纤维化）较乙醇＋CMZ组差（P＜0.05）。乙醇模型组大鼠的肝脏纤维化病灶较明显，这种纤维化主要存在于肝小叶中心或者细胞外周。乙醇模型组大鼠的肝脏与乙醇＋CMZ组相比，有明显的脂肪性病变、坏死及炎症。见表4。

葡萄糖对照组可见肝小叶轮廓清晰，小叶中央静脉向四周呈放射状排列，肝细胞排列尚整齐，细胞分界清，核圆，位于细胞中央，胞质丰富，呈嗜碱性（见图1A）。乙醇模型组可见肝小叶结构破坏，肝板排列紊乱，呈点、片状坏死，肝细胞肿胀明显，胞质中可见大小不等、数量不一的圆形脂肪空泡，散在肝细胞嗜酸性变，小叶中央静脉周围和汇管区有炎症细胞浸润，有的肝细胞质中有红色颗粒状Mallory小体（见图1B）。乙醇＋CMZ组大鼠肝细胞浊肿明显减轻，有散在炎症细胞浸润，肝细胞内偶有小脂滴（见图1C）。葡萄糖＋CMZ组也偶见脂肪空泡，肝细胞肿胀明显，胞体肿大成球形，小叶中央静脉周围和汇管区有炎症细胞浸润（见图1D）。

表4 4组大鼠肝脏病理分级 （n =6，分，±s）

表4 4组大鼠肝脏病理分级 （n =6，分，±s）

组别 脂肪性病变 坏死 炎症 纤维化 总分葡萄糖对照组 0.17±0.11 0.83±0.45 0.83±0.45 0.10±0.01 1.83±1.15乙醇模型组 3.01±1.07 1.14±0.59 1.63±0.52 0.75±1.04 6.45±2.34葡萄糖+CMZ组 0.25±0.12 0.1±0.01 0.62±0.34 0.10±0.01 0.85±0.48乙醇 +CMZ 组 1.82±1.05 0.14±0.06 0.64±0.31 0.10±0.01 2.54±1.28 FA值 3.227 32.282 12.706 2.317 16.615 PA值 0.088 0.000 0.002 0.144 0.001 FB值 51.299 1.291 5.862 2.320 27.606 PB值 0.000 0.269 0.025 0.143 0.000 FA×B值 4.230 0.759 5.346 2.316 5.937 PA×B 值 0.053 0.394 0.032 0.144 0.024

图1 CMZ对酒精性肝损伤大鼠肝组织病理变化的影响 （HE×10）

2.4 CMZ对酒精性肝损伤大鼠肝组织CYP酶和MDA含量的影响

乙醇模型组CYP2E1蛋白表达量高于葡萄糖对照组和葡萄糖＋CMZ组（P＜0.05），表明乙醇诱导大鼠体内CYP2E1蛋白的表达（见图2）。但乙醇模型组与乙醇＋CMZ组的CYP4A和CYP3A相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；乙醇模型组与葡萄糖对照组、乙醇＋CMZ组、葡萄糖＋CMZ组的MDA含量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），乙醇模型组的MDA含量高于其他各组。见表5。

图2 4组大鼠CYP2E1蛋白的表达

表5 CMZ对酒精性肝损伤大鼠肝组织CYP酶和丙二醛含量的影响 （n =6，±s）

表5 CMZ对酒精性肝损伤大鼠肝组织CYP酶和丙二醛含量的影响 （n =6，±s）

组别 CYP2E1/（UA/mg） CYP4A/（UA/mg） CYP3A/（UA/mg） MDA/（pmol/mg）葡萄糖对照组 37±15 65±27 153±101 34.9±7.1乙醇模型组 233±17 126±57 239±165 58.7±21.8葡萄糖+CMZ组 22±13 111±57 121±65 31.1±9.3乙醇 +CMZ 组 215±79 158±91 349±158 37.5±9.1 FA值 0.971 2.293 0.546 5.273 PA值 0.336 0.146 0.469 0.033 FB值 131.155 4.476 8.929 7.831 PB值 0.000 0.047 0.007 0.011 FA×B值 0.012 0.079 1.800 2.561 PA×B 值 0.915 0.782 0.195 0.125

2.5 CMZ对酒精性肝损伤大鼠肝组织CYP2E1蛋白表达的影响

鼠肝小叶部位免疫组织化学法染色显示，乙醇模型组染色区域与乙醇＋CMZ组基本一致（见图3A）。葡萄糖对照组染色面积较小，仅见于中心部位的肝脏细胞。葡萄糖＋CMZ组与乙醇＋CMZ组相比，肝小叶CYP2E1阳性区域明显缩小（见图3B）。

图3 两组大鼠肝组织中CYP2E1的表达

2.6 CMZ对酒精性肝损伤大鼠肝组织蛋白酶体活性的影响。

2.6.1 糜蛋白酶活性 4组大鼠糜蛋白酶活性比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=17.436，P=0.000）。两两比较经LSD-t检验，乙醇模型组的糜蛋白酶活性低于葡萄糖对照组和葡萄糖＋CMZ组（P＜0.05）；乙醇＋CMZ组的糜蛋白酶活性与乙醇模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表6和图4。

2.6.2 类胰蛋白酶活性 4组大鼠类胰蛋白酶活性水平比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=11.457，P=0.000）。两两比较经LSD-t检验，乙醇模型组的类胰蛋白酶活性较葡萄糖对照组降低（P＜0.05）。见表6和图5。

2.6.3 谷氨酰肽水解酶活性 4组大鼠谷氨酰肽水解酶活性水平比较，经单因素方差分析，差异无统计学意义（F=0.995，P=0.416）。见表6和图6。

表6 4组大鼠肝组织蛋白酶体和CYP2E1活性比较 （n =6，±s）

表6 4组大鼠肝组织蛋白酶体和CYP2E1活性比较 （n =6，±s）

6-羟基氯唑沙宗/氯唑沙宗比值葡萄糖对照组 38.5±10.1 45.6±15.8 6.7±4.5 0.11±0.02乙醇模型组 14.6±3.4 12.5±4.9 14.3±12.6 0.18±0.03葡萄糖+CMZ组 43.2±3.0 23.0±5.2 7.5±6.4 0.05±0.02乙醇+CMA组 24.7±3.0 21.8±6.1 9.8±8.5 0.03±0.03 F值 17.436 11.457 0.995 15.736 P值 0.000 0.000 0.416 0.000组别 糜蛋白酶活性/（nmol/mg）类胰蛋白酶活性/（nmol/mg）谷氨酰酞水解酶活性/（nmol/mg）

图4 4组大鼠糜蛋白酶活性比较

图5 4组大鼠类胰蛋白酶活性比较

2.7 CMZ对酒精性肝损伤大鼠体内CYP2E1活性的影响。

4组大鼠CYP2E1活性水平（6-羟基氯唑沙宗/氯唑沙宗比值）比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=15.736，P=0.000）。 两 两 比 较 经 LSD-t检验，乙醇模型组CYP2E1活性高于葡萄糖对照组（P＜0.05）；葡萄糖＋ CMZ组、乙醇＋ CMZ组CYP2E1活性低于葡萄糖对照组（P＜0.05）；葡萄糖＋CMZ组、乙醇＋CMZ组CYP2E1活性低于乙醇模型组（P＜0.05），表明CMZ不仅抑制体内乙醇诱导的CYP2E1，而且抑制自身固有的CYP2E1活性。见表6和图7。

图6 4组大鼠谷氨酰肽水解酶活性比较

图7 4组大鼠6-羟基氯唑沙宗/氯唑沙宗比值比较

3 讨论

本研究证明，CMZ能够明显改善乙醇诱导的肝脏损伤。虽然CMZ未影响乙醇对CYP2E1的诱导作用，但是最后的实验中，通过CHZ的羟基化体外代谢发现，CMZ同时抑制乙醇诱导的和自身固有的CYP2E1活性。因此，CMZ对改善乙醇诱导的肝损伤的机制可能与体内酶活性的抑制作用有关。本研究发现，大鼠体内CMZ能够减少CYP2E1的合成，与其他研究结果一致[15]。有研究表明，CYP2E1的抗体滴度与肝脏的病理程度、CYP2E1蛋白表达水平有相关性[16]。另外一个不能排除的可能性是在实验末测得的CYP2E1蛋白水平不能反映整个实验期间CHZ对CYP2E1均有抑制作用。

尽管乙醇诱导CYP2E1的表达，但是CMZ降低大鼠体内CYP2E1活性的原因可能是通过结合CYP2E1分子内其他位点而不是酶催化反应的位点，从而非竞争性抑制CYP2E1，酶被诱导的机制是自身稳定化的原因[17]。乙醇的结合会抑制蛋白磷酸-泛素化通路。CMZ同时抑制CYP2E1基因转录，但本实验未对该机制进行深入研究。乙醇模型组与乙醇＋CMZ组的CYP2E1蛋白表达水平无差异，表明CMZ抑制CYP2E1基因转录的机制可能并不是那么重要。乙醇模型组与乙醇＋CMZ组大鼠肝脏病理分级的差异可能是因为CMZ在体内对CYP2E1抑制，其同时解释了乙醇＋CMZ组大鼠CYP2E1活性下降的原因。乙醇诱导的放射性加合物（CYP2E1-羟乙基放射性加合物）依赖于CYP2E1的形成。在乙醇模型组大鼠肝脏中CMZ抑制CYP2E1，而阻止MDA含量的升高。

本实验在研究大鼠代谢乙醇的同时也研究了体内CHZ代谢的情况，表明CMZ通过非竞争性抑制降低体内CYP2E1的活性，在乙醇＋CMZ组中也检测到CMZ抑制大鼠体内CYP2E1的活性。然而在人体酒精戒断期间，乙醇作为非竞争性的抑制剂已被消除掉，CMZ对CYP2E1的活性抑制作用更突出[18]。

CMZ对乙醇诱导的微粒体蛋白酶的活性有抑制作用，但具体机制尚未明确。CMZ抑制体内CYP2E1酶的活性，减轻乙醇诱导的肝脏病理损伤。那么CMZ对乙醇诱导的微粒体蛋白活性的抑制作用是否与CMZ减缓肝损伤有联系，还需要进一步研究探讨。肝脏脂肪性病变和肝细胞蛋白的积累，使乙醇诱导的大鼠肝重增加，在乙醇＋CMZ组大鼠中CMZ的摄入使肝重降低。然而在乙醇模型组中，CMZ不仅降低肝细胞的脂肪性病变程度，而且降低蛋白酶活性。乙醇＋CMZ组大鼠的肝重与乙醇模型组无差异，其原因可能是肝脏蛋白的增加和脂肪细胞丢失的不平衡[19]。本实验中，大鼠的净体重无明显增加或者减轻。肝细胞质中蛋白的积累可能是由于微粒体蛋白活性丢失，造成细胞肿胀而诱发肝损伤，最终导致肝正常血流发生变化。

综上所述，CMZ能够减轻乙醇诱导的肝脏病理性病变。更重要的是CMZ能完全阻止乙醇诱导的肝硬化。CMZ改善乙醇诱导的肝脏病理分级的机制可能是抑制CYP2E1的活性。将CMZ加入乙醇模型组后，乙醇诱导的MDA水平无显著增加，因此说明CMZ有效阻止肝组织的过氧化反应。本实验结果表明，CMZ通过抑制CYP2E1的活性，而有效保护肝脏免受自由基的损伤。CMZ降低乙醇对蛋白酶活性的不良影响，表明CYP2E1产生的自由基可损伤蛋白酶。CMZ同时能抑制CYP2E1的合成。由于肝损伤患者CYP2E1活性较高，因此CMZ作为治疗肝损伤的药物具有很好的应用前景。