HIF-2α和Twist2在乳腺癌中的表达及其与预后的关系

刘琼雯，李秋雨，孙松，李惠翔

（郑州大学第一附属医院 病理科，河南 郑州 450052）

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤。缺氧微环境是恶性肿瘤浸润和转移的始动因素，缺氧诱导因子-2α（hypoxia-inducible factors, HIF-2α）是为适应缺氧而衍生出的一种碱性-螺旋-环-螺旋（basic-helixloop-helix, bHLH）-PAS蛋白家族转录因子，对促进血管生成、调节增殖凋亡及诱导侵袭转移至关重要[1-2]。Twist2也称为Dermo1，参与肿瘤细胞上皮-间质转化，是癌细胞获得迁徙、侵袭及转移能力的主要因子之一。有研究表明，Twist2是HIF-2α的特异靶基因之一[3]。本实验将进一步探讨两者在乳腺癌中的表达及与预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2011年8月-2012年1月郑州大学第一附属医院病理科存档的乳腺组织石蜡标本143例。其中，乳腺非特殊浸润性癌92例作为乳腺癌组，癌旁正常组织30例作为癌旁正常组织组，纤维腺瘤21例作为纤维腺瘤组。92例乳腺癌组织来源于女性，年龄27～83岁，中位年龄47.50岁，平均年龄49.51岁；组织学分级I级11例，Ⅱ级62例，Ⅲ级19例；TNM分期Ⅰ期6例，Ⅱ期7例，Ⅲ期78例，Ⅳ期1例；伴有腋窝或锁骨下淋巴结转移者51例，未见转移者41例。患者术前均未行放化疗及内分泌治疗，手术切除标本经甲醛固定、石蜡包埋及切片染色，并由2位病理医生进行阅片及分类。

1.2 试剂

鼠抗人HIF-2α单克隆抗体（ab8365）及鼠抗人Twist2单克隆抗体（ab57997）购于美国Abcam公司，免疫组织化学检测试剂盒（SP-9000）及浓缩型二氨基联苯胺（Diaminobenzidine,DAB）试剂盒购于北京中杉金桥有限公司。

1.3 免疫组织化学染色

免疫组织化学染色运用过氧化物酶标记的链霉卵白素SP三步法，具体步骤如下：石蜡切片脱蜡、梯度酒精水化，抗原高压热修复、阻断及封闭，滴加一抗4℃过夜（HIF-2α单克隆抗体1∶2 000、Twist2单克隆抗体1∶200），滴加生物素标记的通用二抗及链霉卵白素-过氧化物酶，DAB染色、苏木精复染，梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。本实验以PBS替代一抗作阴性对照，已知阳性的乳腺癌切片作为阳性对照。

1.4 判定标准

在光镜下呈现棕黄色细颗粒状物质即为显色，HIF-2α蛋白阳性染色主要定位于胞核，部分胞浆中也可见，Twist2蛋白阳性染色主要定位于胞浆。在高倍镜（10×40）下对每张切片随机选择8～10个视野进行计数，染色强度从无色到浅黄、棕黄及棕褐色分别计0～3分；阳性细胞数从0%、＞0%～10%、＞10%～25%、＞25%～50%、＞50%分别计0～4分；将染色强度和阳性百分比相乘，所得数值＞3即为阳性表达[4]。

1.5 随访

患者的生存结局经查阅病历、电话等形式获得，从术后第1天开始计算到患者死亡或末次随访止为总生存时间，随访日期截止到2016年12月31日，最长随访时间59个月，平均随访时间为44.78个月，中位随访时间为47.00个月。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计学软件，计数资料以率（%）表示，比较用χ2或Fisher检验，Kaplan-Meier法绘制生存曲线，比较用Log-rank χ2检验，相关性分析用Pearson法，影响因素的分析用Cox比例风险回归模型，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组的HIF-2α、Twist2蛋白表达

乳腺癌组、癌旁正常组织组及纤维腺瘤组HIF-2α蛋白阳性率分别为71.73%、36.66%和42.85%，其中92例乳腺癌中，HIF-2α阴性（-）26例（28.26%），弱阳性（+、++）49例（53.26%），强阳性（+++）17例（18.47%）。3组HIF-2α表达阳性率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05），乳腺癌组高于纤维腺瘤组和癌旁正常组织组。3组Twist2蛋白阳性率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05），乳腺癌组高于纤维腺瘤组和癌旁正常组织组。见表1和图1、2。

2.2 各临床病理特征乳腺癌患者的HIF-2α、Twist2阳性率比较

不同肿瘤大小、有无淋巴结转移乳腺癌患者的HIF-2α阳性率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05）。不同组织学分级、有无淋巴转移及雌激素受体乳腺癌患者的Twist2阳性率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表1 各组HIF-2α、Twist2蛋白的比较

图1 各组HIF-2α蛋白的表达 （SP×200）

图2 各组Twist2蛋白的表达 （SP×200）

表2 各临床病理特征乳腺癌患者的HIF-2α、Twist2阳性率比较

续表2

2.3 乳腺癌组中HIF-2α、Twist2蛋白表达的相关性

乳腺癌组中HIF-2α、Twist2蛋白均阳性表达35例（38.04%），均阴性表达14例（15.22%），HIF-2α蛋白阳性而Twist2蛋白阴性患者5例（5.43%），HIF-2α蛋白阴性而Twist2蛋白阳性患者9例（9.78%），乳腺癌中HIF-2α与Twist2的表达呈正相关（r=0.452，P=0.000）。

2.4 HIF-2α、Twist2蛋白表达与乳腺癌患者预后的关系

乳腺癌HIF-2α、Twist2蛋白阴性患者5年生存率分别为96.1%和89.2%，乳腺癌HIF-2α、Twist2蛋白阳性患者5年生存率分别为80.3%和78.6%，HIF-2α、Twist2蛋白阴性与阳性患者5年生存率比较，差异有统计学意义（χ2=5.599和5.515，P=0.018和0.023），两者均为影响乳腺癌预后的因素。无论HIF-2α还是Twist2蛋白，其阴性患者生存曲线均较平缓，相对于阳性患者拥有更高的5年生存率及更长的生存期。见图3、4。

将年龄、肿瘤大小、分级、分期等因素纳入Cox比例风险回归模型中，多因素生存分析显示，淋巴结转移、HIF-2α阳性和肿瘤直径＞2 cm可作为乳腺癌患者预后的影响因素（P＜0.05）。见表3。

图3 乳腺癌HIF-2α阳性与阴性患者的生存曲线

图4 乳腺癌Twist2阳性与阴性患者的生存曲线

表3 乳腺癌患者预后影响因素的Cox多因素分析

3 讨论

HIF-2α是20世纪90年代末提取出来的细胞因子，包涵bHLH-PAS结构域成分[5]。HIF-2α和最先在人类基因组中发现且研究较为普遍的缺氧诱导因子-1α在结构上有48%的氨基酸序列同源性。可被缺氧环境诱导表达，在肾透明细胞癌、胰腺癌及肝癌等众多肿瘤中异常表达，且与肿瘤的发生发展、侵袭转移及生存预后均存在关联[6-9]。Twist2也称为Dermo1，该细胞因子的主要作用之一是与真皮发育相关，在进化过程中高度保守，Twist蛋白家族是一种含有bHLH结构的转录因子，Twist2和Twist1相比，其结构相似性高达66%，但是两者的功能尚不一致[10]。Twist2在多数非癌组织中呈低表达或不表达，而在众多实体瘤中呈高表达，并参与细胞上皮间质转化过程，是癌细胞发生浸润转移的主要影响因素之一[11]。HIF-2α和Twist2均归属于bHLH-PAS家族成员，Twist家族是HIF-2α的特异靶基因，两者参与调控细胞增殖分化、新生血管形成、肿瘤增殖和转移等过程[12]。研究显示，缺氧微环境及HIFs介导的众多低氧信号通路在诱发上皮间质转化（epithelial- mesenchymal transition,EMT）过程中起到了关键作用[13]。YANG等[14]研究发现，HIF-2α在胰腺癌EMT中起关键作用，通过介导Twist2对E-cadherin进行下调而引发EMT，从而引起肿瘤侵袭转移。HIF-2α可以促进体外癌细胞迁移侵袭，并调节E-cadherin和基质金属蛋白酶的表达，对EMT的发生和进行至关重要。ZHOU等[15]发现高转移性囊腺癌细胞HIF-2a和Twist2的表达均高于低转移性囊腺癌细胞，唾液腺囊腺癌HIF-2a和Twist2阳性表达与肿瘤周围神经侵犯、局部复发和远处转移均密切相关，并推测缺氧环境与EMT之间存在相关性。

淋巴结转移是明确的判断乳腺癌预后指标之一，乳腺癌中HIF-2α和Twist2蛋白的阳性表达提示患者预后不良。HIF-2α可能通过Twist2介导乳腺癌细胞的上皮间质转化，促进肿瘤转移，缩短生存期。HIF-2α和Twist2有可能作为乳腺癌预后判断和靶向治疗的生物学标志物。