多重荧光PCR方法检测食品中致病菌的实用研究

◎ 董 睿，孙端方

（1.贵州中烟工业有限责任公司技术中心，贵州 贵阳 550009；2.贵州省产品质量监督检验院，贵州 贵阳 550016）

《国家食品安全监督抽检实施细则》和根据此标准制定的各省市县级食品监抽细则，食品中致病菌是食品检测的主要对象。致病菌检测包括沙门氏菌（以下简称“沙门”）、金黄色葡萄球菌（以下简称“金葡”）、水产品中副溶血性弧菌（以下简称“副溶”）、肉制品中单核细胞增生李斯特菌（以下简称“单增”）、牛肉制品中大肠埃希氏菌O157:H7/NM等。

致病菌检测的强制国标方法均以筛选培养法为主体，经过多重筛选选出疑似阳性样品后，采用生化方法进行验证，检测过程耗时较长、工作量大。多重荧光PCR法在初筛环节以其检测迅速、操作量低等明显优势，在科研领域已得到反复验证，但在国内监抽领域还未采用相关方法。

本研究以沙门、金葡、副溶、单增为检测对象，验证多重荧光PCR法在实际食品中致病菌的应用，选用以往省抽备样中的检出样品，设计引物和探针进行检测；以GB 4789.4-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验沙门氏菌检验》、GB 4789.7-2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》、GB 4789.10-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》、GB 4789.30-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》为方法对照。

1 材料与方法

1.1 样品

调取以往省抽备样中分别只检出了沙门、金葡、副溶或单增的食品各10批次，分别设为沙门、金葡、副溶、单增的阳性对照，再互为其他3种菌种的阴性对照，并在检验过程中设空白对照。

1.2 方法

1.2.1 荧光PCR法

先按GB 4789.4-2016、GB 4789.7-2013、GB 4789.10-2016、GB 4789.30-2016中初次增菌方法进行取样培养。DNA提取试剂盒为Toyobo MagExtractor®Genome，荧光PCR试剂为Toyobo Thunderbird qPCR Mix，引物探针，见表1。体系配制及反应参数按试剂说明书。荧光PCR仪为ABI 7500 Fast。

表1 多重荧光PCR引物及探针表

1.2.2 国标方法

按 GB 4789.4-2016、GB 4789.7-2013、GB 4789.10-2016、GB 4789.30-2016检测。

2 结果与分析

图1示例了分别只检出沙门、金葡、副溶或单增的食品各1批次的FAM、HEX、TAMRA、Cy5荧光信号，其中作为阳性对照的荧光呈显著的S形曲线增长，且Ct值＜30.0，作为阴性对照的荧光无信号增长且Ct值＞40.0，结果见表2。其余批次也符合实验要求。该结果表明多重荧光PCR方法可准确区分沙门、副溶、金葡、单增，也与国标检测和生化检测的结果相符。

图1 多重荧光PCR信号曲线图

表2 多重荧光PCR检测结果表

3 讨论

食品中致病菌检测的国标方法通常为3～5 d，基本为纯人工操作，费时费力；并且在初筛、复筛的平板菌落挑取过程中，存在肉眼判断误差；同时在实际检测中，成千上万的样品数量使得上述缺点非常显著。普通PCR法检测食品中致病菌，检测时间缩短为2 d左右，操作简便；在实际检测中，样品数量越多，相对国标方法效率提升越高。

多重PCR在普通PCR基础上，通过运用多对引物检测目的基因，成倍提升检测效率；荧光PCR作为第二代PCR技术，通过监测探针或染料在PCR扩增时的荧光信号变化以计算检测结果，大幅提高了准确性。多重荧光PCR在荧光PCR基础上，通过运用多条探针检测目的基因，结合上述两种方法优点，同时提升检测效率和准确性，可逐步运用于日常检测工作。