猪背最长肌蛋白质 在冷冻贮藏过程中的变化

李 靖,马 嫄,*,岳文婷,袁乙平,蒋珍菊

(1.西华大学食品与生物工程学院,四川成都 610039; 2.西华大学西华学院,四川成都 610039; 3.西华大学理学院,四川成都 610039)

我国作为肉类消费大国,猪肉在居民膳食结构中占据着很大的比重[1],每年人均猪肉消费量占肉类总消费量的50%以上。肉的组成结构、质构及很多加工特性都是通过蛋白质来实现的[2],在冷冻保藏过程中蛋白质的变化会直接影响肉的营养水平和加工特性[3]。肌原纤维蛋白作为肌肉中含量最多的蛋白,对外界环境变化敏感,如水分冻结、盐浓度变化等都会导致其结构的变化,并最终影响肉的品质。目前关于肉在冻藏过程中变化的研究大多集中于不同冷冻方式、冷冻温度等冷冻条件对肉品质以及加工特性等的影响[4-6],主要关注解冻损失、蒸煮损失、质构、蛋白流失率等方面[7],关于不同冻藏时间对肉中蛋白质特性变化的研究较少。

猪背最长肌作为骨骼肌的一种,其肌纤维在猪的生长发育过程中呈现明显的发育性变化规律[8],且加工中多用其作为主要原料进行生产。故本文以猪背最长肌为研究对象,探究其在不同冻藏时间后解冻,肉中蛋白质的变化情况,包括蛋白质溶解度、肌原纤维蛋白的表面疏水性变化和降解,以及蛋白质的热稳定性变化,为猪肉的冻藏条件优化及不同冻藏时间肉的品质评定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

猪背最长肌 购自本地农贸市场,大约克夏猪,宰杀前重量约100 kg,宰杀后于4 ℃冷却12 h;氯化钠、氯化镁、EGTA、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、Tris-HCl、EDTA、氯化钾、氢氧化钠、硫酸铜 成都市科龙化工有限公司,均为分析纯;8-苯胺基-1-萘磺酸铵盐(ANS)、二-硫代二硝基苯甲酸(DTNB) 美国Sigma公司;SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、5×蛋白上样缓冲液 美国Solarbio公司;蛋白标准Marker 6.5～200 kDa 日本Takara公司。

BCD-649WE型冰箱 青岛海尔科技有限公司;MJ-BL25C4型搅拌机 美的公司;Heraeus multifugeX1R型冷冻离心机 德国Thermo Fisher公司;spectraMax i3x型酶标仪 美国Molecular Devices公司;DYY-8C型电泳仪 北京六一仪器厂;DSC1型差示扫描量热仪 瑞士,梅特勒-托利多公司。

1.2 实验方法

1.2.1 猪背最长肌的处理 将猪背最长肌剔除表面筋膜、脂肪等组织,平行于肌纤维方向切分,每块100 g左右。而后将肉铺平,利用保鲜袋将其包裹完整,置于-18 ℃冰箱冻制24 h后转移至冷库长期冻藏,冻藏温度-18 ℃。冻藏时间分别为:0 d和1、3、6、9、12、15个月,而后将肉样取出,于4 ℃解冻24 h,测定相关指标(冻藏0 d的肉样即将肉样放于-18 ℃冰箱冻制24 h后取出于4 ℃立即解冻进行各指标的测定)。

1.2.2 蛋白质溶解度的测定 参考牛力[9]的方法,取1 g样品切碎,加入0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液(含1.1 mol/L的碘化钾,pH=7.2),搅拌30 min,于4 ℃保存20 h,2600×g离心30 min,取上清液1 mL,利用双缩脲法测定蛋白质浓度,以牛血清蛋白做标准曲线,得到的标准曲线公式为:y=0.0364x-0.0002,R2=0.9996,其中y为吸光度,x为蛋白质溶解度。

1.2.3 猪背最长肌肌原纤维蛋白(Myofibrillar protein isolate,MPI)的提取 取不同冻制时间的肉样采用honikel袋法[10]于4 ℃冰箱解冻24 h,将解冻后的肉样利用4倍缓冲液(0.1 mol/L NaCl,2 mmol/L MgCl,1 mmol/L EGTA,10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4,pH=7.0)匀浆后离心(4 ℃,2000×g,15 min),重复四次,第三次离心前利用0.1 mol/L NaCl洗涤匀浆,第四次离心前利用四层纱布过滤去筋膜,滤液调pH至6.0,沉淀,离心(4 ℃,2000×g,20 min),得到的蛋白膏即为猪背最长肌肌原纤维蛋白[4,11]。采用双缩脲法测定蛋白膏中的蛋白质浓度。

1.2.3.1 MPI表面疏水性的测定 将MPI利用蛋白质缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl 含0.6 mol/L KCl)从0.02～0.12 mg/mL稀释成若干梯度,而后将4 mL蛋白质稀释液+50 μL ANS溶液(利用0.1 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4,pH=7.0 缓冲液配制成8 mmol/L的ANS溶液)室温下反应15 min,利用酶标仪测定荧光强度,激发波长390 nm,吸收波长470 nm,梯度浓度溶液的荧光强度斜率即为蛋白质的表面疏水性[10-11]。

1.2.4 MPI的SDS-PAGE分析 利用1.2.3.1中蛋白质缓冲液将MPI稀释至10 mg/mL,取4 mL蛋白稀释液按照4∶1加入1 mL的5×Buffer,3000 r/min常温离心2 min,沸水浴6 min,冷却至常温后,3000 r/min常温离心2 min,-30 ℃以下保存。电泳用分离胶浓度为12%,采用恒流23 mA进行电泳分离。用0.5 g/L的考马斯亮蓝R250染色2～3 h,然后脱色至背景透明,照相并分析电泳条带[13]。

1.2.5 猪背最长肌的热力学性质测定 将不同冻藏时间的猪背最长肌样品于4 ℃解冻24 h后送至四川大学分析测试中心进行差示量热扫描(DSC)测定。测定条件:在30 ℃条件下,以3 ℃/min升到100 ℃,利用仪器自带的软件对热流变化曲线进行分析,计算样品变性温度、热变性焓值[14]。

1.3 数据处理与分析

实验数据采用SPSS 15.0进行方差分析(one way ANOVA)、显著性分析,不同显著性数据用不同字母进行标记,利用Originlab 8.0进行图形的绘制。

2 结果与分析

2.1 猪背最长肌蛋白质溶解度的变化

由图1可知,在15个月的冻藏过程中,猪背最长肌中的蛋白质溶解度呈现逐渐降低的趋势。在冻藏的前3个月内,蛋白质溶解度尽管有所下降,但维持在200 mg/g以上,其中冻藏1个月和3个月的肉样蛋白质溶解度由于冻藏时间较短,而且间隔的时间不长,冻藏对蛋白的破坏程度较低,因此差异不显著。随着冻藏时间的延长,蛋白质溶解度下降速率加快。冻藏12个月后,与初始相比较,其溶解度下降了56%,冻藏15个月时,蛋白质溶解度已下降到65.27 mg/g,仅为初始值的1/4左右,差异极显著(p<0.01)。这是由于盐析作用、细胞内外溶液浓度的变化以及胶体结合水的冻结等一系列作用导致蛋白质的变性[2,15],如蛋白质疏水结构、巯基,进而引起蛋白质功能性的变化[16]。蛋白质溶解度的降低是肌肉品质下降的重要指标,因为肌肉蛋白质的功能特性只有在蛋白质处于高溶解状态下才能表现出来。

图1 猪背最长肌在15个月冻藏期内蛋白质溶解度的变化Fig.1 Change of protein solubility in pork longissimus dorsi during 15 months of frozen storage注：不同字母表示差异显著(p<0.05);图2、图3同。

2.2 MPI表面疏水性的变化

由图2可知,在15个月的冻藏期内,猪背最长肌肌原纤维蛋白的表面疏水性(梯度浓度溶液的荧光强度斜率即为蛋白质的表面疏水性)呈现逐渐变大的趋势。在前3个月的冻藏期,MPI的表面疏水性变化较小,维持在3000左右;随着冻藏时间的延长,从第6月开始,表面疏水性逐渐增加;在冻藏15个月后,表面疏水性达到了7007.48,表明在冻藏过程中蛋白质的结构已经发生了一定程度的改变[17]。因为在冻藏过程中由于持续的冻结和细胞内盐浓度的增加,肌原纤维蛋白疏水性区域内的氨基酸侧链疏水性残基暴露出来,蛋白质对水分的束缚作用减小,蛋白质之间的氢键作用、疏水结构发生改变[18-19]。

图2 猪背最长肌MPI在15个月 冻藏期内表面疏水性的变化Fig.2 Surface hydrophobicity(So-ANS)of pork longissimus dorsi myofibril protein isolated(MPI)during 15 months of frozen storage

2.3 MPI巯基含量的变化

从图3可知,MPI的巯基含量随冻藏时间的延长逐渐增加,前6月的变化较小,从最初的4.476 mol/105g增长到4.809 mol/105g,差异不显著。但随着冻藏时间的延长,从第6月开始,巯基含量出现显著增加(p<0.05),且增长速率逐渐增加,到冻藏15月后,巯基含量达到了7.213 mol/105g。肌球蛋白、肌动蛋白的巯基基团主要埋藏于蛋白质的内部,巯基在维持蛋白质的三级、四级结构上有着重要作用[3],同时也可衡量蛋白质的氧化程度。在冻藏的过程中由于肌原纤维蛋白的降解以及二硫键的破坏,导致了蛋白质的巯基含量的上升。同时,MPI的表面疏水性(So-ANS)值升高也反映出了蛋白质结构随着冻藏时间的延长展开程度不断增加,从而使得巯基不断暴露。

图3 猪背最长肌MPI在15个月冻藏期内巯基含量变化Fig.3 Sulfhydryl(SH)contents of pork longissimus dorsi myofibril protein isolated(MPI)during 15 months of frozen storage

2.4 MPI的SDS-PAGE分析

猪肉肌原纤维蛋白中主要包括肌球蛋白、肌动蛋白、肌联蛋白、肌钙蛋白等多种蛋白质。图4反映了不同冻藏时间猪背最长肌肌原纤维蛋白的降解情况,随着冻藏时间的延长,位于67 kDa和20～29 kDa附近的蛋白质变化最为明显,67 kDa为肌动球蛋白(actomyosin)的降解[20],辅肌动蛋白(actinin)和肌动蛋白(actin)的降解在整个冻藏考察期内不明显,而肌动球蛋白的降解可能与冻藏时间的延长、冰晶体增长、盐浓度增加有关。

图4 猪背最长肌MPI在15个月 冻藏期内的SDS-PAGE电泳图Fig.4 SDS-PAGE patterns of pork longissimus dorsi myofibril protein isolated(MPI) during 15 months of frozen storage

2.5 猪背最长肌蛋白质的热力学性质

从图5和表1中可知,猪背最长肌中蛋白质有3个特征吸热峰分别在48～52 ℃、61～64 ℃以及75～77 ℃附近,分别代表:肌球蛋白、肌浆蛋白、肌动蛋白变性引起的吸热变化[21]。变性温度反映了蛋白质的稳定性,变性温度越高,其稳定性也高;变性焓值反映了蛋白质变性程度的大小,其值越大,说明变性程度越小,抗变性能力越强[22]。结果表明:随着冻藏时间的延长,猪背最长肌肌球蛋白和肌浆蛋白的变性焓值显著降低(p<0.05),表明这两类蛋白质的稳定性降低,冻藏时间的增加对蛋白质造成了一定程度的损伤;而肌动蛋白的变性温度、变性焓值显著增加(p<0.05),说明肌动蛋白的热稳定性和抗变性能力较强。冷冻对蛋白质的伤害主要来自两方面：一是胶体结合水冻结破坏了组织蛋白质的性质,削弱了蛋白质与水之间的亲和力,且这种变化是非可逆的,二是水分的冻结引起细胞内汁液中盐浓度的升高,渗透压的增加不仅促进了水分的析出,也进一步加速了蛋白的变性[15]。

表1 猪背最长肌在15个月冻藏期内的DSC分析结果Table 1 DSC result of pork longissimus dorsi during 15 months of frozen storage

图5 猪背最长肌在15个月冻藏期内的DSC图谱Fig.5 DSC curve of pork longissimus dorsi during 15 months of frozen storage

3 结论

随着冻藏时间的延长,肌原纤维蛋白的疏水性氨基酸残基和巯基不断从蛋白质内部暴露出来,从而使得蛋白质的表面疏水性和巯基含量升高,同时蛋白质溶解度显著降低(p<0.05),由于肉的许多加工特性都是在蛋白质处于溶解状态时体现的,因此可以确定肉的加工特性随着时间的延长也会逐步降低;15个月的冻藏期内,肌球蛋白和肌浆蛋白的热稳定性降低,而肌动蛋白的抗变性能力较强,发生降解的蛋白质主要是67 kDa的肌动球蛋白以及20～29 kDa范围内的蛋白质。综上所述,在冻制的前3个月内蛋白质溶解度、结构变化及热稳定性等都维持在较好的水平,从第6个月开始,其变化速率加快,变化幅值增加,因此冻藏6月以后背最长肌中蛋白质品质开始加速下降。