基于HS-SPME-GC-MS法优化酱牛肉中挥发性风味物质萃取条件

李 娟,韩 东,米 思,李 侠,张春晖

(中国农业科学院农产品加工研究所/农业部农产品加工综合性重点实验室,北京 100193)

酱牛肉是我国传统酱卤肉制品中的特色产品,其香味浓郁,口感丰厚,受到广大消费者的喜爱和推崇[1]。酱牛肉是将牛肉预煮后,用肉桂、丁香、黄酱、料酒等香辛料和调味料煮制的肉制品,因其配料和加工方式不同,使酱牛肉具有不同的风味。风味是评价酱牛肉品质的重要指标之一,同时也是消费者购买产品的重要依据。风味的形成是由于加工过程中美拉德反应、脂肪氧化降解、硫胺素热降解等共同作用的结果[2]。近年来,对酱牛肉中风味物质的相关研究有大量文献报道,主要集中在酱牛肉风味物质不同分析方法的对比[3-4]、酱牛肉加工过程中风味物质含量变化[4-5]、酱牛肉风味物质形成等方面[6-7]。对于酱牛肉挥发性风味物质萃取条件优化方面研究较少。

目前,风味物质提取方法多采用同时蒸馏萃取法、微波辅助萃取法[8]、溶剂辅助蒸发法[9]、热脱附法[10]、固相微萃取法等。固相微萃取(solid phase micro-extraction,SPME)作为一种集吸附、浓缩、进样为一体的无溶剂样品前处理方法,被广泛应用于食品、医药及环境等领域,具有操作方便,样品用量少,灵敏度高等特点[11]。对于肉制品的风味物质前处理,Ma等人[12]运用SPME-GC-MS进行了煮制牛肉中风味物质的提取和鉴定,得到24种风味成分;郭青雅等人[13]对羊肉臊子的风味物质进行了研究,用SPME法提取后,确定了35种气味化合物;Corral等人[14]采用SPME-GC-MS技术研究了发酵香肠中的风味物质,共检出95种化合物;Iglesias等人[15]用SPME-GC-MS技术对氧化鱼肉中的挥发性风味物质进行了研究,共鉴定出79种化合物。故本文运用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱(Headspace solid phase micro-extraction and gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)联用技术研究酱牛肉中挥发性风味物质,对固相微萃取法进行条件优化,建立酱牛肉挥发性风味物质测定的最佳分析方法,初步确定酱牛肉中重要的风味物质,以期为今后酱牛肉风味品质调控提供有益参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

稻香村酱牛肉(真空包装,300 g) 北京稻香村专卖店,保质期为90 d,主要配料有牛肉、黄酱、香辛料、酱油、白酒、大豆分离蛋白等。

QP 2010 Plus型气相色谱质谱联用仪 日本岛津公司;100 μm 聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)、65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙基苯(polydimethylsiloxane/divinylbenzene,PDMS/DVB)、50/30 μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane,DVB/CAR/PDMS)、自动SPME进样器 美国Supelco公司;Waring SS110实验室组织捣碎机 上海默西科学仪器有限公司;20 mL顶空进样瓶 宁波哈迈仪器科技有限公司;赛多利斯BSA423S电子天平 赛多利斯(中国)有限公司;YC-300L低温冷藏柜 中科美菱低温科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 剔除酱牛肉表面冻卤、可见筋腱,将剩余酱牛肉用组织捣碎机捣碎至颗粒状。之后称取一定量样品置于20 mL顶空进样瓶,旋紧瓶盖。在分析测定前,放于4 ℃低温冷藏柜中备用。

1.2.2 气相色谱质谱条件 SPME条件:萃取头在使用前,应在GC进样口老化相应时间(100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB萃取头分别在250 ℃老化0.5 h,50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头在270 ℃老化0.5 h)。取出装酱牛肉的20 mL顶空进样瓶,将老化完成的萃取头插入进样瓶,预热20 min后在一定温度条件下吸附一定时间,解析2 min后,进行GC-MS分析。

GC条件:DB-WAX型毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);载气为He,流速1.6 mL/min;分流进样,分流比为2∶1;采用程序升温,具体为:初始温度40 ℃,保持3 min,以5 ℃/min上升到120 ℃,再以10 ℃/min升温至200 ℃,保持33 min。

MS条件:电离方式:EI,电离电压70 eV,离子源温度200 ℃,扫描方式为全扫描,扫描范围m/z 35～500。

1.2.3 萃取头筛选实验 称取3.0 g样品,预热20 min,在60 ℃条件下吸附40 min,后在230 ℃解析2 min,考察 100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头对酱牛肉挥发性风味物质萃取效果的影响。

1.2.4 单因素实验 依据有关文献的报道[16-21],单因素实验中选取萃取温度、萃取时间、解析温度、样品质量为实验因素,进行相应条件优化,以研究其对总峰面积、风味物质种类的影响。

在保持萃取时间为40 min,解析温度为230 ℃,样品质量3.0 g,及其他条件不变的情况下,分别选取萃取温度为50、60、70、80、90 ℃进行优化,以选取合适萃取温度。

在保持萃取温度为60 ℃,解析温度为230 ℃,样品质量3.0 g时,及其他条件不变的情况下,分别进行萃取时间30、35、40、45、50 min的顶空固相微萃取实验,以选取合适萃取时间。

在保持萃取温度为60 ℃,萃取时间为40 min,样品质量3.0 g,及其他条件不变的情况下,分别进行解析温度200、210、220、230、240 ℃的顶空固相微萃取实验,以选取合适解析温度。

在保持萃取温度为60 ℃,萃取时间为40 min,解析温度为230 ℃,及其他条件不变的情况下,分别选取样品质量为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g进行优化,以选取合适样品质量。

1.2.5 响应面优化实验 在单因素实验基础上,应用Box-Behnken中心组合实验设计原理,以总峰面积作为响应值,进行四因素三水平响应面实验,确定HS-SPME-GC-MS分析酱牛肉风味物质的最佳条件。实验因素及水平见表1。

表1 响应面实验因素水平表

1.3 定性定量方法

酱牛肉挥发性风味物质通过气相色谱分离,后经质谱分析鉴定,得到总离子色谱图。利用计算机检索并与NIST11质谱库进行匹配作初步分析,再结合人工谱图解析,确定化合物,完成定性分析;按峰面积归一法对挥发性风味物质进行定量分析。

1.4 数据处理

采用SPSS 20.0软件对单因素实验进行分析;利用Design-Expert 8. 0. 5b软件进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 萃取头的确定

由表2可知,在相同条件下,65 μm PDMS/DVB、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头分别鉴定出33、32种化合物,而100 μm PDMS萃取头仅分离得到13种化合物;与其他两种萃取头相比,65 μm PDMS/DVB萃取头有较大总峰面积,故萃取头选取65 μm PDMS/DVB。

表2 不同萃取头对挥发性风味物质萃取效果的影响

2.2 单因素实验

2.2.1 萃取温度对萃取效果的影响 萃取温度对风味物质的萃取效果有很大影响。其影响通过样品在三相间的扩散系数和分配系数来实现。升高萃取温度时,样品中分子运动加快,随之扩散速率会加快,即扩散系数增大;萃取温度过高时,使萃取头固定相发生解析,从而降低样品中分子吸附,使分配系数减小[22]。由图1可知,随着萃取温度的升高,总峰面积先增大后减小,70 ℃时总峰面积达到最大,而风味物质种类随着萃取温度的升高略有减少。总峰面积、风味物质种类在70 ℃后下降,可能是不易挥发的大分子物质吸附在萃取头上,使挥发性小分子物质很难吸附上去,从而使总峰面积、风味物质种类下降[23]。综上,选取70 ℃作为萃取温度进行下一步实验。

图1 萃取温度对挥发性风味物质萃取效果的影响

2.2.2 萃取时间对萃取效果的影响 萃取时间对萃取头的吸附量和萃取效果有较为重要的影响。SPME是一种基于样品挥发性风味物质在顶空与萃取头薄膜上的动态分配平衡过程,而萃取时间即为萃取达到平衡时所需要的时间,一般萃取过程均在刚开始时吸附量迅速增加,到一定的点位后上升就很缓慢[24-25]。由图2可知,萃取时间为30～50 min时,风味物质种类和总峰面积呈现先增加后下降的趋势,其中,45 min时,风味物质种类最多。但在40～45 min时,总峰面积变化不显著(p>0.05),基本趋于平稳,说明萃取头在45 min便能达到饱和。通过分析色谱图发现,保留时间在40 min后,仍有一些主要风味物质出现,如果缩短萃取时间,将不利于这些物质的挥发和吸附,减少风味物质析出。因此,选取45 min作为萃取时间。

图2 萃取时间对挥发性风味物质萃取效果的影响

2.2.3 解析温度对萃取效果的影响 解析温度对固相微萃取时的解析时间和萃取效果有较大的影响,结果如图3所示。若解析温度过低,则有可能因解析不完全,导致下一次的吸附误差;若解析温度过高,会使萃取头涂层脱落,增加含硅物质的大量析出,并有可能使一些吸附的风味物质发生氧化等[26-27]。由图3可知,解析温度为200～210 ℃时,随着解析温度的增大,总峰面积和风味物质种类减少,可能是210 ℃时萃取头涂层中含硅物质析出,主要风味物质减少,总峰面积变小。解析温度为210～230 ℃时,总峰面积、风味物质种类呈现不断增加的趋势,230 ℃达到最大值,之后随着解析温度增大,总峰面积和风味物质种类开始减小。故选取230 ℃为后续实验的解析温度。

图3 解析温度对挥发性风味物质萃取效果的影响

2.2.4 样品质量对萃取效果的影响 样品质量对萃取时间、萃取效果有较大影响,当样品质量越大,萃取头吸附物质越多,总峰面积越大;当样品质量过多,会导致预热时受热不均匀,使物质不能很好地挥发,相应地会降低萃取效果[28]。由图4可知,样品质量为2.0 g时,总峰面积达到最大,风味物质种类也较多,随后两者均在减小,可能是萃取头吸附出现饱和,不能萃取更多的风味物质[29]。故选取的样品质量为2.0 g。

图4 样品质量对挥发性风味物质萃取效果的影响

2.3 响应面法优化分析

根据单因素实验结果,以萃取温度(A)、萃取时间(B)、解析温度(C)、样品质量(D)为影响因素,总峰面积作为响应变量,利用Design-Expert 8. 0. 5b软件设计响应面实验,结果见表3。

表3 响应面设计方案和结果

利用Design-Expert 8.0.5b软件对实验数据进行多元回归分析,得到回归方程:Y=3.98+4.32A+0.53B+0.85C+0.10D-0.33AB-0.19AD+0.21BC-0.08BD-0.12CD+2.53A2+0.90B2+0.27C2+0.84D2,其中各项系数的绝对值大小表示各因素对响应变量的影响程度。根据实验数据进行响应面方差分析,结果见表4。

该拟合模型p值<0.0001,说明模型极显著(p<0.01),表明实验方法可行;失拟项不显著(p=0.2472>0.05),说明回归方程拟合度较好,实验误差比较小;其中决定系数R2=0.9590,表明回归方程效果好,预测具有可靠性。由表4可知,回归模型中一次项A、C和二次项A2对总峰面积的影响极显著(p<0.01),说明二次项B2、D2对总峰面积的影响显著(p<0.05)。从表4所列的F值大小可知,4个因素对总峰面积影响程度大小依次为:萃取温度>解析温度>萃取时间>样品质量。

表4 方差分析结果

用Design-Expert 8.0.5b软件绘制响应面图,萃取温度、萃取时间、解析温度、样品质量两两交互作用对响应值总峰面积的影响如图5所示。从5图中可知,其两两交互作用均不显著。通过对回归模型进行分析,得到固相微萃取的最适条件为:萃取温度68.95 ℃,萃取时间46.51 min,解析温度239.89 ℃,样品质量1.68 g,在此条件下,预测总峰面积为1.44×108。考虑到实验可行性和局限性,上述条件修改为:萃取温度70 ℃,萃取时间45 min,解析温度240 ℃,样品质量2.0 g,得到总峰面积1.46×108,风味物质种类为44种,实际总峰面积与理论预测总峰面积相比,其相对误差为1.37%,说明响应面法对萃取条件的优化具有可行性。

图5 萃取温度、萃取时间、解析温度、样品质量两两交互作用对萃取效果的影响

2.4 酱牛肉挥发性风味物质检测

根据上述最佳萃取条件,对酱牛肉挥发性风味物质进行萃取,其HS-SPME-GC-MS色谱图如图6所示。挥发性风味物质种类及相对含量结果见表5。

图6 酱牛肉挥发性风味物质总离子流图

HS-SPME-GC-MS法检测到的酱牛肉挥发性风味物质结果见表5,共检测出44种挥发性风味物质,其中醛类9种(51.29%)、醇类8种(8.61%)、酮类4种(6.49%)、醚类2种(6.75%)、酯类6种(4.76%)、酸类4种(2.43%)、烃类2种(0.58%)、含氮含硫及杂环化合物9种(16.78%)。

表5 酱牛肉挥发性风味物质种类和相对含量

续表

醛类阈值大多较低,是肉类风味的主要成分之一,主要来源于脂肪的氧化降解和斯特雷克氨基酸反应[30]。酱牛肉中检出的醛类物质有己醛、庚醛、壬醛、苯甲醛、大茴香醛、十六醛、肉豆蔻醛等,己醛是亚油酸的主要氧化产物[31],苯甲醛是苯丙氨酸降解产物[32],大茴香醛、肉豆蔻醛可能来源于八角茴香、小茴香等物质中。醇类来源于脂肪的氧化降解,其饱和醇由于阈值高,对酱牛肉风味贡献较小,而不饱和醇由于阈值低,对风味贡献较大[33];酱牛肉中检出的桉叶油醇、4-萜烯醇、α-松油醇,具有樟脑般清凉香味、胡椒香味、丁香花味,是重要的风味贡献物质。酮类是脂肪氧化降解的另一重要产物,对肉风味形成极为重要,其中3-羟基-2-丁酮具有令人愉快的奶香味[34]。

醚类主要来源于香辛料,检出的茴香脑、草蒿脑可能来自于添加的八角茴香、小茴香、大茴香等物质,其赋予酱牛肉愉快的香气和醇厚感[35-36]。酯类、酸类是脂肪酸和醇缩合、脂肪氧化降解形成的,由于阈值较高,因此对酱牛肉风味贡献不大,但它们是一些杂环化合物形成的重要中间体,具有不可忽视的基底作用[37]。烃类主要来源于脂肪酸烷氧基的均裂和脂肪降解,分为饱和烃和不饱和烃,饱和烃阈值较高,对风味影响不大,不饱和烃阈值较低,对风味影响较大;如酱牛肉中检出了不饱和烃甲苯[38]。含氮含硫及杂环化合物阈值较低,是肉品中最重要的风味物质,主要通过美拉德反应,氨基酸和硫胺素热解生成;其呋喃类物质是最丰富的美拉德反应产物,如酱牛肉中检出的2-戊基呋喃、4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮,具有肉品的烘烤味和坚果味[39-40]。

3 结论

本实验基于HS-SPME-GC-MS方法,对北京稻香村酱牛肉中的挥发性风味物质的萃取条件进行了优化并对其挥发性风味物质进行了研究。通过优化,顶空固相微萃取的条件为:选取65 μm PDMS/DVB萃取头,在样品质量2.0 g,萃取温度70 ℃,萃取时间45 min,解析温度240 ℃,解析时间为2 min时,萃取效果较好,得到总峰面积1.46×108,风味物质种类为44种,实际总峰面积与理论预测总峰面积相比,其相对误差为1.37%,说明响应面法对萃取条件的优化具有可行性。共检测到醛类、醇类、酮类、醚类、酯类、酸类、烃类、含氮含硫及杂环化合物8类物质,其中醛类、含氮含硫及杂环化合物的相对含量较高,分别为51.29%±2.80%和16.78%±1.10%,且阈值低,是北京稻香村酱牛肉中主要的挥发性风味物质,对其风味贡献较大。