基于电子鼻技术研究壳聚糖/ε-聚赖氨酸复合膜对中国对虾的保鲜效果

张 振,柏 韵,郭雪松,李丹丹,*,李 然,*

(1.锦州医科大学食品科学与工程学院,辽宁锦州 121001;2.沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110866)

中国对虾是中国的特产,是我国分布最广的对虾类,在国际市场上广受欢迎[1]。虾肉中的蛋白质含量丰富,必需氨基酸指数为72.98%,是高品质蛋白质[2],同时脂肪含量较低。然而,虾肉中的高蛋白质和含水量使虾在死后肌肉组织较松软,自溶作用迅速,新鲜度下降明显,易发生腐败,严重影响其营养价值和食用性[3],因此,虾的保鲜问题已经成为人们研究的热点。壳聚糖是由自然界广泛存在的几丁质经过脱乙酰作用后得到的产物,具有良好的成膜性能[4]、抑菌性[5]、安全无毒性[6]等优良性能被广泛关注,其作为保鲜剂正日益成为果蔬贮藏保鲜研究的热点。

对虾在贮藏过程中的气味变化是评价其鲜度的重要指标之一。传统的感官评价方法主观因素较大,精确性低[7]。电子鼻检测是一种操作简单、检测速度快,灵敏度高的技术,主要通过气味指纹信息对气体或挥发性成分做定性或定量的检测,目前在食品领域已得到广泛应用[8],同时可以对样品进行多重分析[9]。

本实验通过响应面确定复合涂膜的最佳配比,同时以空白组和单独涂膜组进行对比,对中国对虾进行保鲜。利用电子鼻主成分分析(PCA)方法和线性判别分析(LDA)方法对数据进行处理分析,并且结合感官评价、pH、挥发性盐基氮值,探究涂膜处理对中国对虾保鲜的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

中国对虾 选择平均体重(15±2) g的中国对虾，购自中国锦州市大润发超市,将新鲜的虾样在购买后1 h内转移到实验室;壳聚糖(脱乙酰度为大于85%,食品级)、卡拉胶 河南洪鑫食化有限公司;ε-聚赖氨酸 山东欣鼎生物科技有限公司;盐酸、氧化镁、磷酸三丁酯、硼酸 分析纯,天津市风船化学试剂科技有限公司。

PEN3便携式电子鼻 德国Airsense公司;FA2004N分析天平 上海精密科学仪器有限公司;DK-98-Ⅱ电子万用炉 天津市泰斯特仪器有限公司;KQ3200B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;PHS-3C型精密pH计 上海雷磁仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 将购买回的中国对虾冰冻致死,备用。将壳聚糖溶解在含1%冰醋酸的蒸馏水中,然后依次加入卡拉胶和ε-聚赖氨酸,150 W超声20 min辅助溶解,制成复合保鲜剂。将中国对虾随机分成三组,一组为无处理的空白组,其余两组分别在壳聚糖单独保鲜剂和复合保鲜剂中浸泡5 min,取出于室温沥干,分装到聚乙烯无菌密封袋中,4 ℃冰箱中贮藏。

1.2.2 TBA测定 准确称取样品5～10 g,置于100 mL有盖三角瓶内,加入25 mL三氯乙酸混合液,振摇半小时。用双层滤纸过滤,除去油脂,滤液重复用双层滤纸过滤一次。准确移取上述滤液5 mL置于25 mL比色管内,加入5 mL TBA溶液,混匀,加塞,置于90 ℃水浴内保温40 min,取出,冷却1 h,移入小试管内,8000 r/min离心5 min,上清液倾入25 mL纳氏比色管中于532 nm波长比色,对照标准曲线y=1.0097x+0.0129得到微克数(同时做空白实验,用5 mL蒸馏水代替上述滤液置于25 mL比色管中,其余步骤不变)。

1.2.3 响应面实验设计 通过预实验得到壳聚糖、ε-聚赖氨酸和卡拉胶最佳添加量,利用Box-Behnken实验,以三者不同质量分数为考察因子,以贮藏期第1、4、8、12 d硫代巴比妥酸值(TBA)含量的总和作为响应值,建立响应值与考察因子之间的二次多项式回归模型。

表1 因素水平表

1.2.4 电子鼻检测 称取1 g虾肉,搅碎后置于50 mL小烧杯中,用双层保鲜膜封口,顶空时间20 min。经预实验确定的电子鼻参数为:样品进样速率300 mL/min,载气速率300 mL/min,清洗时间60 s,检测时间60 s。电子鼻传感器性能描述见表2[10]。

表2 电子鼻传感器性能描述

1.2.5 pH的测定 称取1 g剁碎的虾肉,加入9 mL煮沸后冷却的蒸馏水,均匀搅拌,静置 30 min,用pH计测定上清液pH。

1.2.6 挥发性盐基氮(TVB-N)的测定 参照GB 5009.228-2016食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定[11],按半微量定氮法测定TVB-N。

1.2.7 感官评定 根据赵海鹏[12]感官评定标准进行改动。评定小组由7人组成(六女一男),虾的评定项目由体表色泽、气味、肌肉形态组成,总分值在 9 分(非常新鲜)和0 分(完全腐败)之间,3分以下为不可接受,具体评分标准见表3。

表3 感官评定评分表

1.2.8 统计分析 数据表示为平均值,做三次平行。使用Box-Behnken响应面设计、Winmuster、SPSS软件进行分析。显著性p<0.05。

2 结果与分析

2.1 响应面实验

2.1.1 二次多项式回归模型的建立及显著性检验 利用Design-Expert 8.0.6进行响应面设计,以储藏期内TBA含量总和(Y)为响应值,响应面实验结果如表4所示,对表进行回归分析,得到回归方程Y=0.705-0.328A-0.582B-0.829C+0.025AB+0.086AC+1.7137BC+0.086A2+0.835B2+1.345C2。

表4 响应面实验设计结果

2.1.2 响应面分析与优化 为检验回归方程有效性,对回归模型进行方差分析和显著性检验,结果如表5所示,F模型=23.10,p=0.0002<0.01,说明回归模型差异显著,回归方程相关系数R2=0.9674,实验误差小,而方程的失拟项F值=0.8,p=0.5559>0.05差异不显著,该二次回归模型是适当的,与实际实验拟合较好,用该模型适合优化复合涂膜对中国对虾品质变化的影响。对各实验指标进行显著分析,A、B、C、BC、A2、C2均有极显著差异(p<0.01)。

表5 响应面回归方程方差分析表

三维(3D)响应曲面可以作为回归方程的图形来表示,用于确定变量的最优值,并被广泛用于更好地理解所考虑范围内变量之间的相互作用[13]。如图1(a)所示,当ε-聚赖氨酸质量分数为0、卡拉胶处于一定水平时,TBA值先随壳聚糖浓度的增加而降低,然后逐渐增大。这可能是由于壳聚糖在虾壳上形成了保护膜,阻碍了部分氧和微生物,使得脂肪氧化速率和微生物代谢减少,随着贮藏期的增加,细菌繁殖能力增强,使得TBA的含量不断上升。如图1(b)所示,当卡拉胶胶质量分数为0、壳聚糖质量分数达到一定水平时,随着ε-聚赖氨酸质量的增加,TBA总量先减少后增加,这是由于ε-聚赖氨酸具有广谱抗菌活性,细胞壁完整性和微生物蛋白质合成受到破坏,最终导致细胞死亡,但ε-聚赖氨酸不具有良好的抗氧化性,小分子(醛、酮、酸等),脂肪氧化程度增加。图1(c)显示当壳聚糖质量分数为0、ε-聚赖氨酸质量分数达到一定水平时,随着卡拉胶含量的增加,TBA含量先降后升,膜性能先随着卡拉胶添加量的增加而增加,水蒸汽透过率和细胞呼吸作用减弱,但添加量超过一定量后膜性能下降,脂肪氧化率增加,导致TBA值升高。

图1 响应面实验曲面图

2.1.3 确定复合涂层的最佳比例 通过Design-Expert V 8.0.6分析的结果显示,复合涂膜的最佳配方为壳聚糖1.81 g/L,卡拉胶0.19 g/L,ε-聚赖氨酸0.13 g/L。在这个条件下,进行验证实验。三次实验结果的平均值为0.3028 mg/mL,与预测值0.3007 mg/mL接近,模型可靠。

2.2 电子鼻检测

2.2.1 电子鼻传感器响应值变化分析 如图2所示,三中处理方法的响应值在60 s内均可达到稳定,不同处理方法的响应值均有明显不同,说明中国对虾在贮藏过程中的气味变化可以用电子鼻PEN3系统检测。图2为三种处理方法在贮藏第13 d时，对中国对虾气味检测的雷达图,如图3所示,传感器7(W1W)、传感器9(W2W)和传感器2(W5S)响应值较明显。雷达图可以直观地表示不同涂膜处理的差异,其中空白组的响应值最大,说明在贮藏期内空白组中的中国对虾有大量挥发性物质产生,气味明显。复合涂膜组的响应值少于壳聚糖单独涂膜,说明涂膜均可有效地抑制挥发性物质产生,且复合涂膜效果优于单独涂膜。

图2 电子鼻对3种涂膜处理的响应曲线

图3 电子鼻对3种涂膜处理的雷达图

2.2.2 不同涂膜处理对虾的电子鼻响应值的PCA分析 图4为贮藏13 d时,不同涂膜处理对中国对虾的PCA分析的响应值。第1主成分贡献率为99.37%,第2主成分贡献率为0.35%,两者之和达到99.72%,数据有效可靠。涂膜处理组均与空白组距离较远,说明在贮藏期间空白组中的挥发性成分与涂膜组有明显区别,但图中复合组和壳聚糖组之间有部分重合,说明主成分分析并不能完全将此两种方法区分开,因此还需要进行LDA分析。

图4 不同涂膜处理对中国对虾的PCA分析

2.2.3 不同涂膜处理对虾的电子鼻响应值的LDA分析 图5为贮藏13 d时不同涂膜处理对中国对虾的LDA分析,如图5所示,各处理组之间距离较远,没有任何重叠,说明LDA分析可以更好的区分三种处理方法,在贮藏期间不同处理组的挥发性物质有一定的区别。第1、第2贡献率之和达到99.89%,数据可靠。

图5 不同涂膜处理对中国对虾的LDA分析

2.2.4 Loadings分析 Loadings分析是对不同传感器的贡献率进行分析,对电子鼻各传感器重要性进行判别[14]。传感器的响应值越接近原点(0,0),则该传感器的识别作用基本可以不计;当传感器的响应值距原点越远,则该传感器的识别性能越强[15]。图6为贮藏13 d时空白组Loadings分析图。如图6可知,总贡献率为99.72%,其中传感器W1W(无机硫化物)和W2W(有机硫化物)对第一主成分贡献率较大,W5S(氮氧化合物)和W3C(氨水)传感器对第2主成分贡献率较大。研究表明[16]中国对虾随着贮藏期的增加,微生物作用明显,虾肉中的蛋白质等发生降解,一些挥发性物质随之产生,其中三甲胺、硫化氢、氨气等物质尤为突出,这与电子鼻检测结果一致,说明可以用电子鼻技术监测和检验中国对虾贮藏期内挥发性物质。

图6 中国对虾的Loadings分析

2.3 感官评价

研究显示,pH的变化可以有效地反映对虾的新鲜度[17]。由图7可知,新鲜对虾的pH在7左右,随贮藏天数的增加,pH呈先下降后上升的趋势,其中空白组下降最明显,这是由于虾肉中生成乳酸等酸性物质[18],而复合涂膜处理延缓了这一反应。随着时间继续增加,pH开始增加,这是因为虾肉中的碱性物质开始增多,肌肉中的蛋白质等含氮物质开始被分解成三甲胺、吲哚、组胺等物质[19]。三组处理方法中,复合涂膜组的pH升高得最为缓慢,说明涂膜处理可以有效地延缓虾肉中各物质的变化,使对虾呈现较好的品质。

图7 中国对虾贮藏期间pH变化

挥发性盐基氮是水产品新鲜度鉴定的最有效方法之一[20]。根据国标GB 2733-2015,鲜、冻动物性水产品卫生标准[21],海水鱼、虾中挥发性盐基氮的可接受值低于30 mg/100 g。从图8可知,三个实验组中的TVB-N值都呈现上升趋势,但复合涂膜组在前5 d上升幅度较小,其次是壳聚糖组,空白组上升最明显,说明涂膜处理可以延缓蛋白质分解,在复合组中添加的ε-聚赖氨酸抑菌和卡拉胶增加了膜的抑菌性和机械性,使得保鲜效果更好。从数据上看,空白组早第9 d超出标准,壳聚糖组和复合组分别在第11 d和第13 d超出标准,延长保质期2～4 d。

图8 中国对虾贮藏期间TVB-N变化

如图9所示,贮藏期间中国对虾感官品质逐渐下降,其中空白组下降最明显。根据感官评分表,分数低于3分被认定为不可接受。空白组在第9 d达到2.9分,壳聚糖组在第11 d到达3.1分,接近不可接受值,复合涂膜组在第13 d的评分为2.9分。壳聚糖成膜后在对虾表面形成保护,有效地降低虾肉中挥发性物质的产生,使虾的气味与空白组相比有较好的感官评分,复合组中加入了ε-聚赖氨酸阻碍了微生物的繁殖,卡拉胶可以增强膜的性能,因此复合涂膜比壳聚糖单独涂膜更有效果。

图9 中国对虾贮藏期间感官评价变化

3 结论

通过响应面实验得到复合膜的最佳配比为:复合涂膜的最佳配方为壳聚糖1.81 g/mL,卡拉胶0.19 g/mL,ε-聚赖氨酸0.13 g/mL。此条件下TBA含量为0.3028 mg/mL。

电子鼻检测方法中,通过PCA和LDA两种方法对贮藏期间的中国对虾响应值进行分析,其中PCA方法壳聚糖组和复合组有小部分重叠,并不能完全区分三个处理组。而LDA则显示三种处理方法可以被有效区分,说明LDA方法更有益于用来检测中国对虾中挥发性物质变化。采用Loadings负荷加载方法分析,总贡献率为99.72%,其中传感器W1W(无机硫化物)和W2W(有机硫化物)对第一主成分贡献率较大,W5S(氮氧化合物)和W3C(氨水)传感器对第2主成分贡献率较大。

感官评价、pH和挥发性盐基氮的实验结果表明,三种处理方法之间有明显区别,这与电子鼻检测结果一致,说明电子鼻系统可以用来评价对虾的新鲜程度。其中复合涂膜处理可以更有效地对中国对虾进行保鲜,与空白组相比可将保质期延长4 d。