pH对墨鱼酶解物美拉德反应产物风味的影响

余自琳,郭荣灿,姜 毅,白云霞,刘小玲,*,赵谋明

(1.广西大学轻工与食品工程学院,广西南宁 530000;2.华南理工大学轻工与食品学院,广东广州 510641)

墨鱼又称乌贼,是海洋动物中头足类的一种,其分布地域广泛,是我国主要海产之一。研究表明,它不但具有较高的食用价值,同时也具有较好的抗氧化、抗肿瘤和增强免疫等作用[1-5]。目前市场上以墨鱼为原料的加工食品较少,其原因是在加工过程中其因蛋白质的降解会产生较重的腥气,影响食用,这一现象限制了墨鱼的深加工。美拉德反应是一种非酶促褐变现象,是羰基化合物与氨基化合物之间的反应,它能赋予食物独特的风味[6],在食品的加工与储存中起着非常重要的作用,目前已广泛应用于肉味、海鲜味香精的制作。所以用美拉德反应的方式制备香精可以改善墨鱼加工中的不良风味,同时赋予其特殊的风味。吴靖娜[7]等将鲍鱼蒸煮液与木糖进行美拉德反应后,得到产物丰富、风味独特的海鲜调味品基料。而王茵[8]等用花蛤蒸煮液经美拉德反应后得到花蛤香味浓郁的产物,适合各种海鲜调味品的开发。同时,在美拉德反应的影响因素中,初始pH为最重要的一种[9],其对反应产物影响最大。本研究以墨鱼水解物和葡萄糖-木糖混合糖为原料,通过感官评价、GC-MS、电子鼻和全自动氨基酸分析对不同初始pH下美拉德反应产物中的风味物质进行分析,为开发新型墨鱼味海鲜调味料提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

墨鱼仔 单只50～80 g,广西大学南百超市;复合蛋白酶500 mg(3760000 U/g)、风味蛋白酶500 g(258000 U/g) 丹麦诺维信酶制剂公司;D-(+)-木糖、葡萄糖,纯度≥99% 上海源叶生物科技有限公司;C6～C33正构烷烃标准品 色谱纯 美国Supelco公司;氨基酸分析洗脱液 日立高新技术公司;其余试剂 均为分析纯。

SHZ-8恒温振荡器 国华企业;TD5A-WS低速离心机 湖南湘仪仪器有限公司;DGG-9100 GD 电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司;7890B型GC仪、5977A型MS仪 美国安捷伦公司;57310-U型65 μm DVB萃取头 美国Supelco公司;L-8900全自动氨基酸分析仪 日立高新技术公司;5810型冷冻离心机 德国Eppendorf公司;PEN3型便携电子鼻 德国Asrinese公司。

1.2 实验方法

1.2.1 墨鱼酶解液制备 酶解方法参考王君研[10]的方法,稍加改动。墨鱼取躯干与腕部肌肉部分,洗净煮熟后匀浆,料液比为1∶3 (g/mL),调节pH至7.0,按底物质量的0.3%加入风味蛋白酶和复合蛋白酶(1∶1),置于恒温振荡器中55 ℃酶解6 h后100 ℃灭酶10 min。4000 r/min离心20 min后取上清液,得到墨鱼酶解液。

1.2.2 美拉德反应 将鼓风干燥箱温度控制在120 ℃,按照木糖:葡萄糖质量比1∶1,添加还原糖,添加量为酶解液质量的3%,调节反应初始pH分别为5、6、7、8、9、10,反应时间为60 min,进行美拉德反应,同时通过考察反应产物的感官特性、挥发性风味物质、风味特征和游离氨基酸含量,分析不同pH下墨鱼酶解物美拉德反应产物风味变化。

1.2.3 感官评价 感官评价参照陈德慰[11]的方法,稍加改动。本实验仅考察嗅觉器官与味觉器官感受到的产物特性。根据产物性质,确定产物的五个感官指标,分别是腥味、甜味、苦味、糊味和鲜味,并对以上五个指标采用六分的标度进行感官分析,具体感官评分表如表1。

表1 感官评价得分表

感官评价由本实验室6名食品专业人员组成,其均为研究食品风味方面的人员,接受过感官评价培训,评价结果具有可靠性。取得分的平均值作为对应的得分。

1.2.4 电子鼻分析 取美拉德反应产物20 mL置于100 mL烧杯中,密封后置于50 ℃水浴中加热10 min后进行检测。检测条件如下:传感器室流量300 mL/min,测量样品流量300 mL/min,气流量 400 mL/min,传感器自动清洗时间120 s;清洗时间120 s,测量时间90 s,顶空温度25 ℃。

1.2.5 挥发性物质测定 挥发性物质测定参考L Cai[12]的方法,稍加改动。顶空固相微萃取(SPME)条件:将5 mL美拉德反应产物与1 g NaCl装入10 mL SPME专用瓶中,55 ℃条件下磁力搅拌加热20 min,萃取30 min,结束后立即将萃取头插入230 ℃进样口解析3 min。

GC条件:DB-WAX毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm);载气为氦气(99.999%);载气流速1.0 mL/min;不分流,进样口温度:230 ℃;升温程序:初温40 ℃保持4 min,以5 ℃/min升至230 ℃后保持5 min。

MS条件:电离源为电喷雾电离,离子阱温度150 ℃,GC-MS传输线温度250 ℃,质量扫描范围45～550 u,扫描速率0.220 s/scan。电喷雾电离电子能量70 eV。

挥发性化合物的定性与定量:选择NIST14.0谱库检索结果匹配度大于80的化合物,并根据C6～C33的正构烷烃标准品的保留时间,计算化合物的保留指数(RI),并在The LRI Database on the Web[13]与NIST Chemistry WebBook[14]网上有统计报道文献的香味化合物RI的数据库中,进行比对定性,同时用峰面积归一化法计算物质的相对含量进行定量。

1.2.6 游离氨基酸含量分析 取美拉德反应产物1.000 mL加入1.000 mL 10%的三氯乙酸沉淀20 min后在4 ℃下10000 r/min离心20 min,取上清液,通过0.22 μm水系过滤器后上机分析。主要检测参数如下:日立高效液相色谱柱(4.6 mm×60 mm,1 μm);柱温:135 ℃;进样体积:20 μL;泵流速:0.4 mL/min;双通道检测570 nm和440 nm;分析时间:53 min。

1.2.7 数据分析 采用SPSS 18.0对数据差异性进行分析,每个样品做3次平行实验,采用单因素方差分析(ANOVA)两两比较中 Duncan分析每组之间是否有显著性差异(p<0.05),采用均值±标准差(x±SD)表示。采用Origin 9.0绘图。

2 结果与分析

2.1 感官评价分析

图1是不同初始pH下美拉德反应产物感官评价得分雷达图。由图1可知,在初始pH5～8范围内,随着pH的升高,美拉德反应产物鲜味得分逐渐升高,甜味得分先升高再降低,苦味与腥味得分逐渐降低,在初始pH达到8时,反应产物鲜味突出,苦味与糊味不存在。在初始pH9～10时,美拉德反应产物糊味得分升高,鲜味与甜味得分降低,当初始pH为10时,产物甜味最突出,苦味不存在。通过以上分析可知,初始pH过高(>8)与过低(<6)均使美拉德反应产物整体鲜味不突出,当pH为7时,美拉德反应产物腥味、苦味与糊味不突出,鲜味与甜味最突出。这一实验结果与孙方达[15]等研究结果相似。

图1 不同初始pH下美拉德反应产物感官评价得分雷达图

2.2 电子鼻结果分析

电子鼻是食品气味特征分析中常用的仪器,不同传感器对不同气味物质的灵敏不同,因此可以比较不同气味的差异。由图2知,主成分1贡献率为64.18%,主成分2贡献率为30.32%,主成分1与主成分2贡献率之和达到94.5%,能够较好地反映原始数据的信息,说明电子鼻实验结果可以代表全部样品的整体信息。在主成分1上,从距离上看,pH5与pH7的样品与其余四个样品的差距较大,说明这两个pH下美拉德反应产物的气味成分与其余样品的气味成分上差距明显;在主成分2上,pH5、pH8、pH9和pH10的样品与pH6、pH7的样品差距较大,但pH9与pH10的样品之间相互有重叠,说明pH5、pH8、pH9和pH10的样品这四个pH下的美拉德反应产物的气味成分与其余两个pH下产物的气味成分相差大,但pH9与pH10的样品相互差异较小。

图2 不同初始pH下美拉德反应产物电子鼻PCA图

不同初始pH下美拉德反应产物G/G0值如表2所示,除4号传感器所代表的氢化物与5号传感器所代表的烷烃芳香成分之外,电子鼻其余传感器不同初始pH下美拉德反应产物风味物质响应值均有显著性差异(p<0.05)。其中pH5与pH8的样品在4号传感器上无显著性差异(p>0.05),其余pH的样品在4号传感器上差异显著(p<0.05);除pH10的样品外,其余pH样品在5号传感器上无显著性差异(p>0.05)。说明不同pH反应条件下,美拉德反应的风味产物差异较大。为明确不同pH条件下美拉德反应产物风味成分的具体变化,进一步采用GC-MS分析并鉴定挥发性风味物质。

表2 不同初始pH下美拉德反应产物G/G0响应值

2.3 挥发性物质结果分析

低分子量挥发性化合物是食品气味中重要的香气成分,其种类和含量是影响食品风味的关键因素。由表3可知,在本实验中,共检测出54种挥发性化合物,其中醛类23种、酮类8种、醇类8种、呋喃类6种、吡嗪类4种、噻唑类1种、含氮化合物1种、吡咯1种、含硫化合物2种。

表3 不同pH下美拉德反应挥发性产物分析

续表

醛类物质中因其阈值低的特点,被认为是风味物质中的主要贡献物[16]。其在美拉德反应中主要由氨基酸经过斯特雷克降解形成的α-氨基酮通过缩合而成[17]。本实验中,在初始pH5～7条件下,随着pH升高,醛类物质相对含量由58.25%增加至60.9%;在初始pH8～10条件下,随着pH升高,醛类物质相对含量由54.29%降低至26.62%。可能的原因是,在高pH的条件下,醛与其他物质进入了反应中级阶段,生成了终产物类黑精。孙丽平等[18]也指出美拉德反应速度随介质pH的升高而增大。其中可贡献酱香和肉香的3-甲硫基丙醛在初始pH5～8条件下生成,它同时也是牛肉香气的特征化合物[19];可同时贡献麦芽香与可可香的2-甲基丁醛与3-甲基丁醛在pH9和10的条件下相对含量达到最高,结合2.1中感官评价,在pH达到9和10时,产物主要呈现糊味,与前面实验结果相吻合。

在本实验的美拉德反应产物中,在初始pH5的条件下,产物中呋喃类物质相对含量为28.26%,吡嗪类物质相对含量为0。随着初始pH升高,呋喃类物质相对含量逐渐降低,吡嗪类物质含量逐渐升高。在初始pH10的条件下,呋喃类物质相对含量为0.60%,吡嗪类物质相对含量为18.41%。可能的原因是,在酸性环境中,还原糖经阿马多尔重排并脱氨后,断裂成醛酮类或自身环化成糠醛类化合物[[20],但是氨基在酸性环境中不能发生亲和反应,所以吡嗪在较高pH条件下形成[21]。其中2-乙基呋喃、2-戊基呋喃和顺式-2-(2-戊烯基)呋喃在初始pH5～7条件下相对含量高于初始pH8～10,并且2-乙基呋喃与2-戊基呋喃为产物提供焦香、豆香和果香;3-甲基吡嗪与2,5-二甲基-吡嗪在pH9与10中相对含量高于其他pH,二者可为美拉德反应产物提供烧烤和肉类香味。

醇类物质因其阈值高,所以在香气成分中贡献作用较小[22],但是对食物整体香味有调和作用,使香味整体更加饱满圆润,其来源是脂肪氧化[23]或者羰基化合物还原[24]。在本实验中,在初始pH5～9条件下,随着pH升高,醇类物质相对含量由6.70%增加至12.08%;当初始pH达到10时,相对含量降低至0.67%。1-辛烯-3-醇是典型海鲜香精调配中的主要特征化合物[25],同时在初始pH5～7条件下,1-辛烯-3-醇相对含量明显高于初始pH8～10,在初始pH7时相对含量最高,在初始pH5～9条件下检测出的苯乙醇可为产物贡献花香。在美拉德反应中,酮类物质被认为来自糖降解。在pH8条件下,酮类物质相对含量达到最高,为6.06%,在初始pH达到9与10时,酮类物质种类与含量低于初始pH5～8。本实验中检测出的2-辛酮、3-辛酮和2-壬酮等化合物可为产物贡献脂肪香、干草香和果香等协调香。

含硫物质与三甲胺是典型的海鲜香味物质。在初始pH5～10条件下,随着pH升高,含硫化合物相对含量由0增加至12.33%,三甲胺相对含量由0.05%增加至32.79%。其中二甲基二硫化物与二甲基三硫化物阈值低,但是对海鲜香味贡献大。已有研究表明,这三种物质存在于热加工的海产品中[26],是海鲜风味的重要贡献物质。

2.4 游离氨基酸含量分析

游离氨基酸是生物体中游离出来的氨基酸,并且大都具有一定的滋味特征。由表4可知,本实验中共检测出16种游离氨基酸,除脯氨酸、亮氨酸和色氨酸外,其余氨基酸均在产物中被检出。在pH5～7的范围内,随着初始pH的升高,总游离氨基酸含量由5.725 mg/mL增加至6.303 mg/mL,苦味氨基酸与鲜味氨基酸含量均有增加;在pH8～10的范围内,随着初始pH的升高,总游离氨基酸含量由5.948 mg/mL降低至4.945 mg/mL,其中鲜味氨基酸与苦味氨基酸含量均随着pH的升高而降低。在美拉德反应过程中,肽热降解会生成氨基酸,氨基酸会参与反应或降解成其他物质,反应初始pH越高,美拉德反应速度越快,所以在pH偏高时,游离氨基酸含量降低。虽然鲜味氨基酸含量不能完全代表产物鲜味强度,因为呈鲜味的物质还包括核苷酸和肽等[27],但是结合2.1节中的感官评价结果,鲜味氨基酸含量可以反映出鲜味物质的变化规律[28]。美拉德反应产物中苦味氨基酸含量较高,但是在感官评价中苦味确不突出,这与之前学者[29]研究结果吻合。

表4 不同初始pH下美拉德反应游离氨基酸含量分析(mg/mL)

Kam Huey Wong[30]等研究表明,在酸性pH条件下,不同氨基酸与葡萄糖美拉德反应产物风味不同。在pH5.2条件下,苯丙氨酸与酪氨酸可产生玫瑰花香;精氨酸可产生水果香;异亮氨酸可产生烧焦香味,赖氨酸与缬氨酸可产生令人愉快的焦糖香气。本实验中检测到在美拉德反应产物中,以上几种氨基酸含量较高,并且结合前面2.3节中挥发性产物分析,在pH范围5～6的条件下,产物中苯乙醛呈现玫瑰花香,2-乙基-呋喃与2-戊基-呋喃呈焦糖香气等,产物中的游离氨基酸种类与含量对产物的风味物质影响较大。

3 结论

通过研究不同初始pH对墨鱼酶解液美拉德反应产物风味物质表明,不同初始pH对产物风味物质影响较大。在偏酸性反应条件下,随着反应初始pH的增加,产物鲜味逐渐增加,挥发性化合物中醛类物质相对含量逐渐升高(由58.25%增加至60.9%),呋喃类物质逐渐降低(由28.26%降低至16.95%),游离氨基酸总量逐渐升高(由5.725 mg/mL增加至6.303 mg/mL)。在偏碱性反应条件下,随着反应初始pH增加,产物鲜味逐渐降低,挥发性化合物中醛类物质相对含量逐渐降低(由54.29%降低至26.62%),吡嗪类物质相对含量逐渐升高(由0增加至18.41%),游离氨基酸总含量逐渐降低(由5.948 mg/mL降低至4.945 mg/mL)。在pH7的条件下,产物腥糊味低,鲜甜味突出,醛类物质相对含量最高(60.9%),同时游离氨基酸含量也达到最高(6.303 mg/mL),典型海鲜风味的挥发化合物在pH10的条件下相对含量最高(三甲胺、含硫化合物分别为32.79%、12.33%)。通过美拉德反应制备的热反应产物具有良好的风味与较高的氨基酸含量,可广泛应用于热反应型香精香料的制备,具有较好的市场前景与商业价值。