胞外聚合物对土壤中苯并芘的降解

甄 凯，单德鑫，欧瑞鹏，赵汉青，郭 玉

（东北农业大学资源与环境学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一种普遍存在于环境中的持久性有机污染物，在环境中长期积累会对人类健康和生态环境产生巨大危害，是美国环境保护署公布的优先控制污染物，即便在较低的浓度下也会对动物、人类产生致癌、致畸、致不育作用[1-2]。因此，PAHs污染修复是当前国内外专家学者共同研讨的热点课题，其中，生物修复技术因其处理效率高、降解彻底、不造成二次污染、操作简单、易行和费用低等优点，愈来愈受到学者们的关注。

胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substances，EPS）由微生物细胞分泌，是由多糖、蛋白质和少量的脂类、核酸等构成的有机高分子聚合物质[3]。EPS对微生物细胞表面以及碳源（环境修复微生物中特指污染物）具有重大的影响，甚至是完全取决于胞外聚合物的作用[4]。EPS中包含大量的负电荷官能团，对重金属离子和有机污染物具有很强的结合能力[5-6]。研究结果表明，在PAHs的生物降解过程中，胞外聚合物可提高降解菌对PAHs的亲和力[6]。

迄今为止，还未见有关EPS对土壤中PAHs降解特性的研究报道。因此，本研究选择苯并芘（benzo[a]pyrene，以下简称BaP）为研究对象，它是一种具有5个芳环结构的多环芳烃[1]，由于其化学结构内苯环高度密集、辛醇-水分配系数高，因此，BaP在环境中残留时间长，较难被微生物降解[7]。

本研究考察EPS对土壤表面BaP降解的影响，旨在为探索污染土壤中PAHs的生物修复机制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 假单胞菌是从中国黑龙江省大庆油田污染土壤中筛选、分离、驯化得来，命名为Pseudomonas sp.DNBe-S1（DNBe-S1）。从 DNBe-S1 的纯液体培养物中提取EPS。

1.1.2 供试土壤 土壤样品采自黑龙江省东北农业大学试验农场无污染地域的表层（0～20 cm）土壤，为典型的北方黑土。将土壤样品除去植物残体及其他杂物，在室温下自然风干，磨碎并过2 mm筛，备用。

1.1.3 供试培养基 采用了无机盐培养基，用于DNBe-S1的培养，主要成分有硝酸铵1.0 g/L、磷酸二氢钾0.5 g/L、磷酸氢二钠1.5 g/L、氯化钠1.0 g/L、七水硫酸镁0.2 g/L，并添加BaP作为唯一碳源，蒸馏水1 L，pH值7.0～7.2；培养条件为：350℃，1 252 r/min，湿度为40%，培养36 h，取出待用。

1.2 方法

1.2.1 胞外多聚物（EPS）的形态结构观察 DNBe-S1培养36 h后，取少量样品，在4℃下以2 000×g离心10 min，除去上清液，用超纯水冲洗沉淀物去盐分，制成悬浮液。取少量悬浮液置于载玻片上制成标本，在ZEISSAxioskop型光学显微镜下观察，使用配置MC80显微镜用照相机拍摄。再取少量悬浮液置于盖玻片上，待其自然风干后直接喷金，然后在JSM-7001F型扫描电镜下观察EPS的微细结构。

1.2.2 胞外多聚物（EPS）的提取和组成测定 将培养的DNBe-S1在4℃下以4 300×g离心10 min，除去上清液，用超纯水冲洗沉淀物3次，去除其中的盐分。回收沉淀物并悬浮于超纯水中，然后在4℃下以20 000×g离心20 min以分离EPS。通过0.22 μm膜过滤的上清液被认为是DNBe-S1中的粗EPS。将粗EPS通过透析膜（3 500 Da）在4℃透析48 h进行纯化，每5 h更换一次超纯水。所有低分子量有机化合物和无机离子在该步骤中除去。纯化的EPS样品储存在4℃直至使用[8]。

纯化的EPS样品糖类测定采用硫酸-苯酚法[9]，蛋白质的测定采用Bradford法[10]。

1.2.3 苯并芘（BaP）在土壤中降解的模拟试验 将BaP溶解在甲醇中制备成BaP储备液（0.03mol/L）。准确称取1 000 g风干土壤样品，用滴管吸取BaP储备液加入土壤中，边加边混合，并在通风橱中操作。再用适量甲醇反复冲洗烧杯和转移用滴管，确保BaP完全转移至土壤中。待甲醇挥发完全后充分混合土样，此时土壤样品中BaP含量为100 mg/kg，置于通风橱中使其中的甲醇挥发后备用。为了检验EPS对土壤中BaP降解特性的影响，处理土壤中分别混合5，10，15 mL的EPS悬浮液，在28℃的恒温培养箱中避光培养，混合日期视为第0天。并分别在第 0，7，14，21，28，35 天取样，测定土壤中 BaP 的残留量，每种处理有3个平行，在整个测试周期内，添加无菌水以保持土壤中的含水量在30%。

1.2.4 土壤中苯并芘（BaP）的测定方法 土壤中BaP的提取和测定按照文献[11]进行。

2 结果与分析

2.1 胞外聚合物的组成与形态结构

2.1.1 胞外聚合物的组成 DNBe-S1中的EPS主要成分为蛋白质，含量为68%，而多糖含量较低，仅为3.8%。

2.1.2 胞外聚合物的形态结构 Pseudomonas sp.DNBe-S1及其胞外聚合物的形态如图1所示。从图1可以发现，图1-A中细胞外亮光部分为EPS在细菌中的形态，而图1-B为提取过后的形态。Pseudomonas sp.DNBe-S1为拉丝且含有孔状结构的聚合物。这样的结构为EPS吸附BaP并降解提供了良好的先决条件。

2.2 胞外聚合物对土壤中苯并芘的降解

从图2可以看出，EPS确实可以促进土壤中BaP的降解，未添加EPS的土壤中，第35天，只有20%的BaP被降解。在添加EPS的土壤中，前21 d，土壤中BaP迅速被降解，随着处理时间的延长，降解速度减慢；并且BaP的降解率随着EPS添加体积的增加而提高，第35天BaP的降解率从42%（5 mL EPS）提高到 79%（15 mLEPS）。

3 讨论

EPS中含有较多的负电荷官能团，较少的正电荷官能团[12]。当微生物接近重金属或其他污染物时，细胞壁外的EPS首先与它们进行接触。许多文献报道，通过静电相互作用和配位反应，EPS与金属离子形成配合物[5，13]。因此，有理由推断EPS在界面作用中可能发挥重要作用，同样它在PAHs的生物降解中也可能发挥重要作用。EPS与PAHs的良好接触有利于EPS与PAHs的相互作用。EPS对BaP的降解受到多种因素的影响，如土壤颗粒中BaP的解吸速度。EPS是含有亲水部分和疏水部分的两亲化合物，因此，EPS能够提高疏水物质的溶解性[14]。PAN等[15]研究表明，EPS和菲之间的相互作用是自发的，它们的结合主要是由疏水相互作用决定的。LIU等[16]研究表明，细菌产生的胞外聚合物可以提高土壤中菲的解吸速度。因此，有理由推断EPS也可以提高BaP在土壤表面的解吸速度。还需要进一步的研究来确定EPS与BaP之间具体存在哪种特定相互作用。此外，由于EPS在土壤中自然存在，因此，EPS在土壤修复应用中将受到越来越多的关注。

4 结论

本研究结果表明，从DNBe-S1中提取的EPS主要成分为蛋白质，EPS可以促进土壤中BaP的降解，并且BaP的降解率随着EPS添加体积的增加而提高。这将促使人们更多地关注EPS在多环芳烃污染土壤生物修复中的应用。