柠条组织培养体系的建立

杨俊鸾

（山西省林木育种研究中心，山西 太原 030031）

柠条（Caragana intermedia）为豆科锦鸡儿属（Caragana）落叶大灌木，适于生长在海拔约900～1 300 m的阳坡、半阳坡，它耐寒、耐旱、耐高温，是干旱草原、荒漠地带的旱生灌丛[1-4]。目前，柠条已经成为我国华北、西北及东北西部的固沙造林和水土保持的重要树种之一，是优良的固沙和绿化荒山植物[5-7]，可作饲草饲料[8-11]。同时，它的根、花、种子均可入药[12-14]，对滋阴养血、通经、镇静及杀虫等有良好效果[15-17]。

柠条传统的繁殖方式主要为种子繁殖，但柠条苗木容易受温度、湿度、地形、地势、病虫害等因素的影响，表现为出苗率不高、出苗不整齐等现象[18-19]。但随着我国经济发展，柠条植被在生态建设中越来越受到重视，以至于柠条苗木供不应求的矛盾日渐突出。

为了满足市场对柠条的需求，在实际生产中降低育苗成本，故对柠条进行了组织培养研究。本研究选用柠条茎段作为外植体，KF/MS作为基本培养基加不同比例的激素进行组织培养，对柠条茎段愈伤组织诱导，并进行芽分化、芽的继代增殖和生根培养，产生新的植株。通过研究其最佳的培养条件，旨在获得一套高效的柠条组织培养体系，为今后工厂化育苗奠定了理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

选用当年生的柠条嫩枝作为外植体，柠条嫩枝采自山西省林木育种研究中心的苗圃地，剪取当年生无病虫害处于生长旺盛期的柠条嫩枝作为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体消毒方法和初代接种 选取当年生的柠条嫩枝用流水冲洗干净，将其剪成2 cm左右的茎段（一般要求保留2个左右的腋芽），放入烧杯中，在流水的环境下冲洗30 min，然后用75%的乙醇浸泡摇晃20～25 s，将材料一分为二，一份用0.1%氯化汞浸泡6～8 min，另一份用2%的次氯酸钠浸泡6～8 min。浸泡中不断用消毒镊子搅拌，使外植体充分消毒，然后用无菌蒸馏水冲洗4～5次，即可对茎段进行初代接种，每瓶放1块外植体，接种15 d后统计污染数，查看消毒效果。

1.2.2 培养基的选择和培养条件 柠条繁殖采用KF，MS，1/2 MS为基本培养基，培养条件为LED灯光照培养，光照时间12 h，光照强度为2 000 lx，温度（25±2）℃，湿度70%～80%。

1.2.3 芽诱导培养基中激素浓度的选择 KF和MS基本培养基中分别加入不同质量浓度的6-BA（0.5，0.8，1.0 mg/L）和 NAA（0.3，0.5 mg/L），接种 30 d后，观察2种培养基中茎段诱导不定芽分化的情况。

1.2.4 丛生芽增殖培养基中激素浓度的选择 将分化的不定芽分别接种在不同激素（6-BA和NAA）配比的KF和MS培养基中，6-BA有0.6，1.2，1.5mg/L等3个梯度，NAA有0.2，0.3，0.5 mg/L等3个浓度梯度，参考资料设计最右组合[20]，培养40 d后，观察不定芽的增殖情况。

1.2.5 根诱导培养基 生根培养基选择1/2 MS＋NAA0.3mg/L＋蔗糖30g/L＋琼脂7 g/L，并添加不同含量的活性炭，活性炭含量分别为0，0.3，0.5，1.0，2.0 mg/L。当诱导苗长至5.0 cm时，转接于上述不同活性炭含量的生根培养基中，研究其对柠条生根的影响。

2 结果与分析

2.1 不同消毒剂和消毒时间对外植体消毒效果的比较

外植体消毒的彻底与否直接影响初代的污染率。对于初代培养，虽然外植体进行了表面消毒，但污染仍在所难免。为了提高无菌材料的获得率，提高工作效率，初次接种每瓶一般放1块外植体。由表1可知，2种不同消毒剂的消毒时间都为8 min时，均比消毒6 min的外植体污染率明显降低。在相同的消毒时间下，用2%次氯酸钠处理的外植体污染明显减少，污染率降低；而用0.1%氯化汞处理的外植体污染率较次氯酸钠处理高。由此可知，柠条外植体用2%次氯酸钠消毒效果比较好，消毒时间以8 min为宜。

表1 不同消毒剂、消毒时间对柠条外植体消毒效果比较

2.2 不同培养基对柠条茎段诱导不定芽与不定芽生长的影响

接种后的柠条茎段培养30 d后观察其形成的不定芽数和生长状况（表2）。接种于MS培养基上有不定芽的形成，诱导率为50%；1/2 MS培养基接种的茎段只有少量的不定芽生成，诱导率只有16%，而且不定芽生长状态较差，主要是由于培养基中大量元素的减少使植物生长所需的各种元素不足所导致；接种于KF培养基上的有大量不定芽生成，诱导率达到了96%，且长势良好。所以，选择KF为最佳诱导培养基。

表2 不同培养基对柠条茎段生成不定芽的影响

2.3 不同激素对不定芽分化的影响

激素种类和激素的浓度显著影响柠条不定芽的分化效果。在柠条快速繁殖试验中常用的激素有6-BA，NAA，GA3等[20]。本试验用不同浓度的6-BA和NAA加入KF和MS培养基中，统计观察其不定芽的分化以及扩繁能力（表3）。以KF为基本培养基，当 6-BA为0.8 mg/L，NAA为 0.3 mg/L时，不定芽分化最多，分化率为82.5%；以MS为基本培养基时，不定芽分化率低于KF作为基本培养基的分化率，且分化出的芽颜色为浅绿色，部分芽还有玻璃化现象的发生。所以，柠条不定芽分化的最佳培养基是KF＋6-BA 0.8 mg/L＋NAA 0.3 mg/L＋蔗糖20 g/L＋琼脂7 g/L。

表3 6-BA和NAA组合对柠条不定芽分化的影响

2.4 不同激素配比对丛生芽增殖的影响

以柠条不定芽为试验材料，在KF基本培养基中加入不同的激素配比进行试验，对柠条丛生芽分化增殖最佳条件进行筛选。培养40 d后统计产生的丛生芽数量（表4）。结果表明，MS培养基上丛生芽分化个数较少，且萌生慢；KF培养基上丛生芽分化个数较同等浓度的MS培养基多，且植株生长健壮，所以，KF是最佳培养基。诱导丛生芽效果较好的激素组合为6-BA1.2 mg/L＋NAA0.3 mg/L。

由上述结果可知，适合柠条丛生芽增殖的最佳培养基和激素组合为KF＋6-BA 1.2 mg/L＋NAA 0.3 mg/L＋蔗糖20 g/L＋琼脂7 g/L，增殖率为90%。

表4 柠条茎段丛生芽增殖试验统计结果

2.5 活性炭对柠条试管苗生根的影响

当柠条无根苗生长至5 cm左右时，将其接种至含有不同含量活性炭的生根培养基中。试验所用的培养基为1/2 MS＋NAA 0.3 mg/L，经过约20 d培养后，统计柠条生根情况。

表5 活性炭对柠条试管苗生根的影响

由表5可知，活性炭含量为0时，生根率为52%，根系长，但发根晚，且容易褐化，移栽时容易伤根；活性炭含量为0.5 g/L时，生根率为94%，发根早，且根系好、粗壮，移栽利于成活；活性炭为2 g/L时，根系短、发根晚，生根率最低，为46%。这表明活性炭的含量对柠条生根有明显影响。由此可知，低含量的活性炭不仅能促进试管苗的生根，而且又能吸附培养基中的矿物质和无机盐，改善培养基的透气性，有利于根的诱导和生长。所以，柠条生根的最适培养基为1/2 MS＋NAA 0.3 mg/L＋蔗糖30 g/L＋琼脂7 g/L＋活性炭0.5 g/L。

3 结论

本研究结果表明，柠条茎段培养用2%次氯酸钠浸泡外植体8 min为消毒最佳时间；诱导愈伤、芽分化和增殖的基础培养基为KF，愈伤诱导率为96%；芽分化的最佳激素配比培养基为KF＋6-BA 0.8 mg/L＋NAA0.3 mg/L＋蔗糖20 g/L＋琼脂7 g/L；丛生芽继代增殖培养基为KF＋6-BA 1.2 mg/L＋NAA0.3 mg/L＋蔗糖20 g/L＋琼脂7 g/L，增殖率为90%；生根培养基为1/2 MS＋NAA 0.3 mg/L＋蔗糖30 g/L＋琼脂7 g/L＋活性炭0.5 g/L，生根率为94%。